一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体是涉及一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法和装置。
【背景技术】
[0002]肿瘤的转移是导致癌症病人死亡的主要原因。近年来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)在恶性肿瘤转移过程中的作用日益受到关注。在肿瘤转移过程中，癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液循环系统，少数细胞存活下来成为循环肿瘤细胞，并进一步发展为远端器官转移肿瘤。因此在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有发生肿瘤转移的可能。
[0003]对于癌症病人血液中CTC的计数已逐渐用于癌症治疗的疗效评估。如果能对CTC进行基因组分析将有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制，并为疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。然而，循环肿瘤细胞在病人外周血中存在的数量极其稀少，大约每15 -1O7个单核细胞中才有一个CTC，对体积微小(10 - 50 μ m)的单个细胞的分离，以及对单个细胞及其微量的核酸的提取和分析都对现代生物技术提出了极大的挑战。随着循环肿瘤细胞富集和鉴定技术的提高，单细胞测序技术的发展，对单个循环肿瘤细胞基因组特性进行分析已成为现实。
[0004]在目前的单个循环肿瘤细胞测序的研究中，循环肿瘤细胞的捕获，主要是用偶联EpCAM抗体的免疫磁珠进行CTC阳性捕获。市场上有很多自动化的CTC检测仪器，但大多数价格高昂，市场应用有限。且这种阳性捕获法依赖于肿瘤细胞对EpCAM抗原的表达。而不同组织来源的CTC，细胞表面EpCAM表达水平不同；且肿瘤细胞脱落组织进行血液循环之后好，表面抗原的表达状况会发生很大的变化。因此用这种方法进行CTC捕获，会遗漏很多EpCAM表达较弱或者无表达的肿瘤细胞，导致很多样本CTC检测结果阴性(假阴性)，无法进行单个CTC挑取，以及后续的基因组分析。
[0005]当前的获取单个CTC细胞的方法主要是利用荧光流式细胞分选和激光捕获显微切割技术。这两种方法都对相应仪器设备的性能要求较高，价格昂贵，难以推广应用。因此，本领域技术人员致力于开发一种简单高效的分离单个循环肿瘤细胞的方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法。
[0007]本发明的第一方面，提供了一种单个循环肿瘤细胞(CTC)的分离方法，所述方法包括步骤:
[0008](I)对外周血样本进行阴性富集，获得富集的CTC细胞样本；
[0009](2)分别使用第一突光标记的抗上皮细胞标志物抗体和第二突光标记的抗⑶45抗体对富集的CTC细胞样本进行荧光染色，并对染色后的CTC细胞样本进行稀释；
[0010](3)对第一荧光阳性且第二荧光阴性的目的细胞进行单细胞分离。[0011 ] 在另一优选例中，所述抗上皮细胞标志物抗体为抗EpCAM抗体和/或抗pan-CK抗体。
[0012]在另一优选例中，所述第一荧光为Alexa fluor 488荧光。
[0013]在另一优选例中，所述第二荧光为Alexa fluor 594荧光。
[0014]在另一优选例中，所述步骤(I)中，使用水平离心机对外周血样本进行密度梯度离心，取单个核细胞聚集层制成单个核细胞悬液，接入偶联白细胞表面抗原CD45的免疫磁珠，分离白细胞，从而达到阴性富集CTC的目的。
[0015]在另一优选例中，所述步骤(2)中，在富集的CTC细胞样本中加入PBS清洗一到两次；离心弃上清后用PBS重悬细胞，添加所述第一荧光标记的抗上皮细胞标志物抗体和所述第二荧光标记的抗CD45抗体后进行孵育。
[0016]在另一优选例中，所述第一突光标记的抗上皮细胞标志物抗体与细胞悬液的体积比为 I:20 — 100，优选为 I:40-60ο
[0017]在另一优选例中，所述第二荧光标记的抗⑶45抗体与细胞悬液的体积比为1:20 — 100，优选为 I:40-60ο
[0018]在另一优选例中，所述孵育时间为30min-90min。
[0019]在另一优选例中，所述步骤(3)中，使用基于微径玻璃管的单细胞分离装置分离所述目的细胞。
[0020]在另一优选例中，所述微径玻璃管的内径为15 μ m — 50 μ m,优选为25 μ m —45 μ m0
[0021]在另一优选例中，所述步骤(3)中，先用所述微径玻璃管吸入一段标记物，然后在倒置荧光显微镜下，将单个目的细胞吸入到微径玻璃管中，从而达到单细胞分离的目的。从微径玻璃管移除细胞时，待所述标记物移至微径玻璃管口则表明目的细胞已经从微径玻璃管移除。
[0022]在另一优选例中，所述标记物可以为带颜色的无菌液体或者无菌液体封闭的气泡。
[0023]在另一优选例中，所述无菌液体封闭的气泡可以采用以下方式制备:将所述微径玻璃管插入无菌液体(优选PBS溶液)中立即取出再插入所述无菌液体中，即可制得所述无菌液体封闭的气泡作为标记物。
[0024]在另一优选例中，所述基于微径玻璃管的单细胞分离装置包括依次连接的:微径玻璃管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管；
[0025]其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。
[0026]在另一优选例中，所述方法还包括步骤:
[0027](4)对分离得到的所述目的细胞进行培养或者对分离得到的目的细胞进行核酸或蛋白分析。
[0028]在另一优选例中，所述步骤⑷中，细胞培养体系为:
[0029]在基础培养基(DMEM或PR頂1640)中添加含1% _2% (v/v)原患者血清、胰岛素和/或氢化可的松。
[0030]本发明的第二方面，提供了一种分离单个循环肿瘤细胞的装置，所述装置包括依次连接的:
[0031 ] 细胞采集管、手持管、连通管、微孔过滤器和口吸管。
[0032]其中，所述细胞采集管被设置用于从样品中吸取单个细胞；
[0033]所述手持管被设置用于控制所述细胞采集管；
[0034]所述微孔过滤器被设置用于阻隔微生物。
[0035]在另一优选例中，所述装置还包括第一接头，所述细胞采集管和所述手持管通过所述第一接头连接。
[0036]在另一优选例中，所述第一接头由硅胶制成，在所述接头的一端设有供所述细胞采集管插入的孔。
[0037]在另一优选例中，所述手持管中填充有吸附材料，所述吸附材料优选为脱脂棉。
[0038]在另一优选例中，所述手持管由硬质透明材料制成。所述硬质透明材料包括但不限于玻璃、塑料等。
[0039]在另一优选例中，所述装置还包括第二接头，所述微孔过滤器和所述口吸管通过所述第二接头连接。
[0040]在另一优选例中，所述微孔过滤器的过滤面积为口吸管横截面面积的2-10倍，优选地为3-5倍。
[0041]在另一优选例中，所述微孔过滤器孔径为0.1-0.5 μ m,优选地为0.1-0.22 μ m。
[0042]在另一优选例中，所述细胞采集管为微径玻璃管。
[0043]在另一优选例中，所述微径玻璃管直径为15-50 μ m,优选地为25-45 μ m,更优选地为30 μ m。
[0044]在另一优选例中，所述连通管的长度为30cm-60cm,优选地为50cm。
[0045]在另一优选例中，所述连通管由柔性的材质制成，所述柔性的材质包括但不限于橡胶、PVC、聚烯烃热塑弹性体(TPE)。
[0046]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0047]图1是可继续培养的活细胞染色后在倒置显微镜下观察到的白细胞(WBC)和循环肿瘤细胞(CTC)。其中绿色荧光代表EpCAM、pan-CK等上皮标志物的表达，红色荧光代表白细胞标志物⑶45的表达，Bright为显微镜在明场条件下观察到的细胞形态。其中CTC为绿色荧光阳性，红色荧光阴性；WBC为绿色荧光阴性，红色荧光阳性。
[0048]图2是可用于基因组分析的细胞液染后在倒置显微镜下观察到的白细胞(WBC)和循环肿瘤细胞(CTC)。其中绿色荧光代表EpCAM、pan-CK等上皮标志物的表达，红色荧光代表白细胞标志物⑶45的表达，蓝色荧光为细胞核染料DAPI。其中CTC为绿色荧光阳性，红色荧光阴性；WBC为绿色荧光阴性，红色荧光阳性。
[0049]图3是本发明中提供的单个细胞分离装置结构示意图。
【具体实施方式】
[0050]本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种简单的分离单个循环肿瘤细胞的方法，本发明中利用一种不依赖CTC表面抗原表达的CTC阴性分离法进行CTC富集，然后对富集的细胞进行特异抗体染色标记。之后再通过单细胞分离装置在荧光显微镜下进行单个CTC的分离。
[0051]本发明提供了一种利用循环肿瘤细胞(CTC)阴性富集技术和免疫荧光染色技术对外周血中单个循环肿瘤细胞进行分离的方法，分离得到的单个循环肿瘤细胞可应用于多种细胞、蛋白以及基因组研究。本发明首先利用梯度离心法对实体瘤患者外周血进行梯度离心以去除血浆和红细胞，再利用偶联白细胞特异表面抗原的免疫磁珠去除绝大多数血源性的白细胞