用于制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及制备视网膜组织和视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞等的方法。
【背景技术】
[0002]作为由多能干细胞制备三维视网膜组织的方法，被证明的是通过在无血清培养基中形成均质的多能干细胞的团聚体，将其在基底膜制剂存在下进行悬浮培养，并且在器官培养基中进行悬浮培养来获得多层视网膜组织的方法(非专利文献I和专利文献I )，以及通过在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中形成均质的多能干细胞的团聚体，将其在基底膜制剂存在下进行悬浮培养，并且在含血清培养基中进行悬浮培养来获得多层视网膜组织的方法(非专利文献2和专利文献2)。
[0003][文献列表]
[0004]专利文献
[0005]专利文献1:W0 2011/055855
[0006]专利文献2:WO2013/077425
[0007]非专利文献
[0008]非专利文献1:恥忉代，472，51-56(2011)
[0009]非专利文献2:CellStem Cell ,10(6) ,771-785(2012)
[0010]发明概述
[0011]发明要解决的问题
[0012]需要开发由多能干细胞制备视网膜组织的方法。
[0013]解决问题的手段
[0014]本发明提供由多能干细胞制备视网膜组织和视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞等的方法。
[0015]因此，本发明提供:
[0016][ I ]用于制备视网膜先祖细胞的方法，所述方法包括
[0017](I)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，和
[0018](2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(I)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体(下文中有时被称为本发明的制备方法I);
[0019][2]用于制备视网膜组织的方法，所述方法包括
[0020](I)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
[0021](2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(I)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和
[0022](3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质、作用于BMP信号转导途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质中的任一种，由此获得含有视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层的团聚体(下文中有时被称为本发明的制备方法2)；
[0023][3]用于制备视网膜层特异的神经细胞的方法，所述方法包括
[0024](I)第一步，在无血清培养基中对多能干细胞进行悬浮培养以形成多能干细胞的团聚体，
[0025](2)第二步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(I)中形成的团聚体进行悬浮培养，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质而含有作用于BMP信号转导途径的物质，由此获得含视网膜先祖细胞的团聚体，和
[0026](3)第三步，在无血清培养基或含血清培养基中对步骤(2)中形成的团聚体进行悬浮培养直至目标视网膜层特异的神经细胞出现，所述无血清培养基或含血清培养基各自不含作用于Sonic hedgehog信号转导途径的物质、作用于BMP信号转导途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质中的任一种，由此获得含有含目标视网膜层特异的神经细胞的视网膜组织并且基本上不含非神经头部外胚层的团聚体(下文中有时被称为本发明的制备方法3)；
[0027][4]前述[I]至[3]中任一项的方法，其中所述多能干细胞是灵长类动物多能干细胞；
[0028][5]前述[I]至[4]中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞；
[0029][6]前述[I]至[5]中任一项所述的方法，其中所述步骤(I)和步骤(2)在血清代替物存在下进行；
[0030][7]前述[I]至[6]中任一项所述的方法，其中所述悬浮培养在不存在基底膜制剂的情况下进行；
[0031][8]前述[I]至[7]中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质是一个或多个选自由以下各项组成的组的蛋白质:BMP2、BMP4、BMP7和⑶F7;
[0032][9]前述[I]至[8]中任一项所述的方法，其中所述作用于BMP信号转导途径的物质在自步骤(I)中的悬浮培养开始起的第I天至第15天之间被添加到所述培养基；
[0033][10]用于评估毒性或药物效力的试剂，所述试剂包含视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，所述细胞或组织是通过前述[I]至[9]中任一项所述的方法制备的；
[0034][11]评估测试物质的毒性或药物效力的方法，所述方法包括将视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞与所述测试物质接触，并且检测所述物质对所述细胞或组织的影响，所述细胞或组织是通过前述[I ]至[9]中任一项所述的方法制备的；
[0035][12]用于由视网膜组织的紊乱所致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，所述细胞或组织是通过前述[I]至[9]中任一项所述的方法制备的；
[0036][13]治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞至需要所述移植的受试者，所述细胞或组织是通过前述[I]至[9]中任一项所述的方法制备的；
[0037][14]视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞，其用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病，所述细胞或组织是通过前述[I]至[9]中任一项所述的方法制备的；
[0038]等等。
[0039]发明效果
[0040]根据本发明的制备方法，可以高效制备视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞。在本发明的制备方法中，因为视网膜先祖细胞、视网膜组织或视网膜层特异的神经细胞可以通过在不向培养基添加基底膜制剂的情况下(即，在不存在基底膜制剂的情况下)对团聚体进行悬浮培养来获得，获得的细胞或组织被来源于异源物种的组分污染的风险降低。根据本发明的制备方法，可以有效提供视网膜组织或视网膜相关细胞如视网膜先祖细胞和视网膜层特异的神经细胞以用于化学物质等的毒性或效力评估、移植治疗等目的。
[0041 ] 附图简述
[0042]图1显示在不向培养基添加作用于BMP信号转导途径的物质的情况下，来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光场图像(A)和荧光图像(B)，在开始悬浮培养起的第3天补充有100ng/ml的BMP2的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光场图像(C)和荧光图像(D)，在开始悬浮培养起的第3天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光场图像(E)和荧光图像(F)，在开始悬浮培养起的第3天补充有100ng/ml的BMP7的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光场图像(G)和荧光图像(H)，以及在开始悬浮培养起的第3天补充有100ng/ml的⑶F7的培养基中的、来源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第18天的光场图像(I)和荧光图像(J)。
[0043]图2显示在不向培养基添加作用于BMP信号转导途径的物质的情况下，来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第26天的光场图像(A)、荧光图像(B)和FACS柱状图(C)，在开始悬浮培养的同时(第O天)补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第26天的光场图像(D)和荧光图像(E)和FACS柱状图(F)，在开始悬浮培养起的第I天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第26天的光场图像(G)、荧光图像(H)和FACS柱状图(I)，在开始悬浮培养起的第2天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第26天的光场图像(J)、荧光图像(K)和FACS柱状图(L)，以及在开始悬浮培养起的第3天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第26天的光场图像(M)、荧光图像(N)和FACS柱状图(O)。
[0044]图3显示在不向培养基添加作用于BMP4信号转导途径的物质的情况下，来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第24天的光场图像(A)和荧光图像(B)，在开始悬浮培养起的第6天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第24天的光场图像(C)和荧光图像(D)，在开始悬浮培养起的第9天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第24天的光场图像(E)和荧光图像(F)，在开始悬浮培养起的第12天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第24天的光场图像(G)和荧光图像(H)，以及在开始悬浮培养起的第15天补充有1.5nM的BMP4的培养基中的、来源于dRAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体在开始悬浮培养起的第24天的光场图像(I)和荧光图像(J)。
[0045]图4显示在于开始悬浮培养起的第3天补充有1.5nM的BMP4的培养基中进行悬浮培养直至悬浮培养开始起的第26天的来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体的冷冻切片的GFP荧光图像(A)、使用抗-ChxlO抗体的荧光免疫染色图像(B)和Hoechst染色图像
(C)。
[0046]图5显示在于开始悬浮培养起的第3天补充有1.5nM的BMP4的培养基中进行悬浮培养直至悬浮培养开始起的第117天的来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体的冷冻切片的使用抗-恢复蛋白(Recoverin)抗体的免疫染色图像(A)、使用抗-NrI抗体的免疫染色图像(B)、使用抗-RXR-γ抗体的免疫染色图像(C)、使用抗-ChxlO抗体的免疫染色图像
(D)、使用抗-钙视网膜蛋白(Calretinin)抗体的免疫染色图像(E)和使用抗-钙结合蛋白(Calbindin)抗体的免疫染色图像(F)。
[0047]图6显示在于开始悬浮培养起的第6天补充有1.5ηΜ的ΒΜΡ4的培养基中进行悬浮培养直至悬浮培养开始起的第50天的来源于RAX::GFP敲入的人胚胎干细胞的团聚体的冷冻切片的使用抗-ChxlO抗体的免疫染色图像(A)、使用抗-Pax6抗体的免疫染色图像(B)、使用抗-Crx抗体的免疫染色图像(C)和使用抗-Brn3b抗体的免疫染色图像(D)。
[0048]实施方案描述
[0049]以下详细说明用于实施本发明的方案。
[0050]本发明中的“载体”表示能够将所需的多核苷酸序列转移到目标细胞中的载体。此种载体的实例包括能够在宿主细胞如原核细胞，酵母，动物细胞，植物细胞，昆虫细胞，动物个体和植物个体中自发复制的载体，能够被整合到宿主细胞的染色体中的载体，在适于多核苷酸转录的位置处含有启动子的载体等。
[0051]在这些载体中，适于克隆的载体有时被称为“克隆载体”。克隆载体的实例包括通常具有包含多个限制酶位点的多个克隆位点的载体。例如，可以提及的是SambrookJ和Russell^D-WjauMolecular Cloning(第3版)，，，Appendix 3(Volume 3) ,Vectors andBacterial strains.A3.2(Cold Spring Harbor USA，2