大规模基因工程化活性干酵母的制作方法
【专利说明】大规模基因工程化活性干酵母
[0001] 相关专利申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月28日提交的美国临时专利USSN 61/896,525和2013年10月 29日提交的美国临时专利USSN 61/896，869的优先权权益，运两篇专利的内容全文W引用 方式并入本文。 发明领域
[0003] 本公开设及用于发酵方法尤其是例如生物燃料生产中的改良微生物。
[0004] 发明背景
[0005] 人们越来越多地关注通过可持续的经济型生物学过程来生产所关注的材料。生物 学过程有望利用来自太阳的可再生能量制造此类材料。例如，来自太阳的能量可被存储在 植物的生物分子诸如多糖淀粉和纤维素中。通过对由运些多糖分解产生的单糖进行发酵， 微生物可将太阳的能量转移到对人类具有商业利益的分子中，包括乙醇。传统上通过加热 和化学过程实现了大规模多糖分解，但在过去的几十年里，已采用工业生产的淀粉水解酶 来促进运一分解过程。
[0006] 20世纪80年代出现的重组DNA技术工具已构建出能够表达高水平淀粉水解酶的转 基因生物。目前，常规使用的是每天W油罐车规模由重组微生物产生的O-淀粉酶、葡糖淀粉 酶和普鲁兰酶。然而，通过该方法制备所关注的生物分子是漫长的且本身很低效。例如，能 量首先从太阳转移到植物多糖，再从运些植物多糖转移到产生淀粉水解酶的微生物，然后 利用微生物产生的酶促进被另一微生物所利用的其它植物多糖的分解，最终形成乙醇。因 此，使用同时产生所关注材料和淀粉水解酶的微生物能更有效地利用资源(参见例如，美国 专利5,422,267)。
[0007] 近来，运类方法在燃料乙醇工业W葡糖淀粉酶表达酵母的形式得到了商业实现。 运些方法有望减少昂贵的外源添加酶的使用。然而，在运一新生工业中仍存在许多尚未满 足的需求。一个较大的需求就是，生产和制备易于运输和易于使用的高活性基因工程化微 生物。本发明推进了运项研究。
【发明内容】
[000引本教导内容提供了新型基因工程化酵母菌株。在一些实施方案中，使经基因改造 的酵母菌株生长W制备大规模先前未知水平的活性干酵母。在一些实施方案中，本教导内 容的酵母用于发酵乙醇，并且用于减少外源添加酶(诸如，葡糖淀粉酶)的使用。
[0009] 附图简述
[0010] 图1示出了根据本教导内容的一些实施方案的一些示例性数据。
[0011] 详细描述
[0012] 除非另外指明，否则本教导内容的实施将采用分子生物学(包括重组技术）、微生 物学、细胞生物学、生物化学和动物饲料造粒的常规技术，运些技术均在本领域的技术范围 内。运类技术在文献中已有全面阐述，例如,Molecular Cloning:A LaboratoiT Manual,第 二版(Sambrook等人，1989);OligonucIeotide Synthesis(M.J.Gait编著,1984) ；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编著，1994) ;PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等人编著，1994) ;Gene Transfer and Expression:A Laboratory ManuaKKriegler, 1990)，和Hie Alcohol Tex忧ook( Ingledew等人编著，第五版，2009) 〇
[0013] 除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本教导内容所属 领域普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第2 版，John Wi ley and Sons , New York( 1994)，W 及化 Ie 和 Markham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY(1991)为 本领域技术人员提供了本发明所使用的许多术语的一般性词典。与本文所述的那些类似或 等同的任何方法和材料可用于本教导内容的实施或测试。
[0014] 本文提供的数值范围包括限定该范围的数字。
[0015]
[0016] ^文所用，术语"活性干燥形式"是指根据本教导内容制备的酵母，其中所得产 品具有至少1 X 108、1 X 109、1 X l〇w或2X l〇w个总酵母细胞/g,其中至少50%、60%、70%或 75%为活细胞，并且含水量为3%-10%、4%-9%或5%-8%。在一些实施方案中，活性干燥 形式包含至少2Xl〇w个总酵母细胞/g,至少75%为活细胞，并且含水量为5%-8%。活性干 燥形式与"ADY产品"可互换使用。
[0017] 如本文所用，"总酵母细胞数/g"的测定和"活细臘'的测定根据下面的过程进行。 将ADY样品在Butterfield缓冲液(3M)中稀释，然后置于35°C的水浴中溫育，期间进行频繁 满旋W使样品保持悬浮，并且使用巧光显微镜（化emometec公司的Nucleocounter YC-100) 在2小时内分析，W测量总计数和活酵母细胞的数目。使用巧光标记(舰化丙晚，PI)处理再 水合的ADY样品，死亡的酵母可渗透到其中。为测定总计数，使用裂解剂处理样品，W使所有 酵母细胞死亡，然后用PI处理W测定总计数。
[001引如本文所用，术语"至少一种另外的重组基因"是指除了用于水解淀粉的至少一种 重组基因外整合到酵母基因组中的编码蛋白质的核酸。正如本领域的技术人员所理解的那 样，有多种示例，并且包括本文所提及的任何基因。
[0019]如本文所用，术语"基因工程化酵母"是指将至少一个核巧酸祀向修饰到核巧酸序 列中，得到非天然存在的序列。运种基因改造可W是内源性野生型基因的祀向修饰，内源性 野生型非编码区的祀向修饰，和/或通过将不同生物体的基因或非编码序列插入(此类不同 生物体的基因或非编码区自身任选地成为祀向修饰的对象巧帕奉母中实现(使用此类不同 生物体的遗传物质也称为"重组"）。在本发明中，仅仅通过酵母自身诱变和筛选产生的遗传 变异不认为构成"基因工程化酵母"。可W构成基因工程化酵母的基因的示例有很多，并且 包括植酸酶、木聚糖酶、e-葡聚糖酶、憐酸酶、蛋白酶、淀粉酶(a淀粉酶或的定粉酶或葡糖淀 粉酶）、普鲁兰酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚醋酶、角质酶、氧化酶、 转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、醋酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶、漆酶 和氧化还原酶中的任一种。实际上，根据本教导内容可使用任何酶，并且非限制性示例包括 来自里氏木霉(Trichoderma reesei)的木聚糖酶和来自里氏木霉(Trichoderma reesei) 的变体木聚糖酶(运两种酶均可购自D证ont Industrial Biosciences)，或EP1222256B1中 所述的固有热稳定性木聚糖酶，W及来自黑曲霉（Aspergillus niger)、白曲霉 (Aspergillus kawachii)、塔宾曲霉（Aspergillus 1:ubigensis)、环状芽抱杆菌（Bacillus circulans)、短小芽抱杆菌（Bacillus pumilus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、浅 青紫链霉菌(Neocallimastix patriciarum)、青霉属(Penicillium species)、变铅青链霉 菌（Streptomyces Iividans)、热紫链霉菌（Streptomyces thermoviolaceus)、褐色高溫单 抱菌（Thermomonospora f usca)、哈茨木霉（Tr ichoderma harz ianum)、里氏木霉 (Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)的其它木聚糖酶。另外的酶包括 植酸酶，诸如例如来自曲霉属(AspergiIlus sp.)的植酸酶FinaseL?,可购自AB Enzymes (Darmstadt ,Germany);来自大肠杆菌化.Co Ii)的植酸酶 Phy zyme? XP，可购自 DuPont Nu化ition and Health; W及来自例如W下生物体的其它植酸酶:木霉属、青霉属、镶抱属、 布丘氏菌属、巧樣酸杆菌属、肠杆菌属、青霉属、腐质霉属、芽抱杆菌属和隔抱伏革菌属。纤 维素酶的一个示例是一种纤维素酶（e-葡聚糖酶）Multi传 ct'i' BGL,可购自DuPont Industrial Biosciences, W及来自例如曲霉属、木霉属、青霉属、腐质霉属、芽抱杆菌属、 纤维菌属、青霉属、高溫单抱菌属、梭菌属和肉座菌属等物种的其它纤维素酶。也可W使用 US20060193897A1中所述的纤维素酶和内切葡聚糖酶。淀粉酶可W例如来自诸如曲霉属、木 霉属、青霉属、芽抱杆菌属（例如，枯草芽抱杆菌（B. subtil is)、嗜热脂肪芽杆菌 (B. stearothermophilus)、迟缓芽抱杆菌（B. Ien1:us)、地衣芽抱杆菌（B. Iicheniformis)、 凝结芽抱杆菌(B.coagulans)和解淀粉芽抱杆菌(B.amyIoliquefaciens.)等物种。合适的 真菌淀粉酶来源于曲霉属(AspergiIlus)，诸如米曲霉(A.Oirzae)和黑曲霉(A.niger)。蛋 白酶可来自解淀粉芽抱杆菌（BaciIlus amyIoliquefaciens)、迟缓芽抱杆菌（BaciIlus Ientus)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌（Bacillus Iicheniformis)， W及曲霉属(AspergiIlus)和木霉属（Trichoderma)物种。在一些实施方案中，序列表中的 任一种酶可单独使用，也可与自身或其它酶结合使用。在一些实施方案中，本教导内容提供 了一种经基因修饰的酵母，该酵母含有至少一种编码序列表中存在的至少一种氨基酸序列 的核酸。在一些实施方案中，本教导内容提供了经基因修饰的酵母