植物细胞壁是许多植物产品包括木材的主要成分。木材被用于许多商业目的，例如用于造纸工业的木浆、产生能源，以及建筑。木材是主要由二级木质部的细胞壁构成，二级木质部包括植物微管组织。细胞壁合成是完全依赖于糖类代谢。在维管组织中传输的一些糖类(通常是蔗糖)已被用于木材的生成和发育。
大多数果糖激酶(FRK)是在维管组织中表达的，并影响维管的发育。特别地，随着FRK2(在番茄植物的维管组织中的主要FRK)的表达增加，纤维素和木质素的合成会增强，细胞壁含量会增加。FRK1(它不类似于FRK2)的表达是不会受到抑制，即使果糖浓度的增加进而增加细胞壁的合成。
蔗糖合成酶(SuSy)将蔗糖剪切为UDP-葡萄糖和果糖，它是在维管组织中的主要的蔗糖剪切酶。申请人发现，SuSy和FRK是在维管组织中共表达的。类似于FRK2，SuSy酶活性是由它的终产物果糖反馈抑制的。由SuSy剪切蔗糖所释放的果糖会抑制和下调SuSy活性。结果，分配用于维管和木质部发育的蔗糖的量是受到积聚的果糖的抑制。因此，FRK活性的增强，使果糖磷酸化，降低果糖浓度，将会增强SuSy活性，并分配蔗糖用于维管和木质部的发育。
维管组织的两个主要成分是木质部和韧皮部。木质部将水和矿物质从根部传输到嫩芽，而韧皮部将糖的位置从来源(叶片)转到沉下(非光合)组织。在许多植物中，被传输的糖主要是蔗糖。一些被传输的蔗糖是在维管组织中被剪切，以支持维管发育。
细胞壁主要包括：简单的糖单体的聚合物，由单糖以多种线性或分支的聚合物链接形成的，称为多糖。最丰富的简单糖单体是葡萄糖，而最丰富的聚合物是纤维素。纤维素是线性、无分支的聚合物，由β-1,4链葡萄糖单体构成。在植物细胞壁中发现的其他多糖包括半纤维素，它包括一组由β-1,4链葡萄糖单体组成的多糖，具有侧链，该侧链可包括除了葡萄糖以外的糖，例如木糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖。半纤维素是多糖的非均匀混合物，它的成分对于不同的植物是变化的。半纤维素是运行性地被定义的，以致可以碱将聚合物片段从细胞壁中分离。
除了纤维素、胶质和半纤维素，次生细胞壁还可包括相当数量的木质素。木质素是以一种不溶性聚合物，它主要是负责产生植物茎部的硬度。特别地，木质素用作围绕一些植物细胞壁的多糖成分的基质。总的来说，木质素含量越高，植物越硬。例如，树种合成大量的木质素，木质素含量占木材的干重的20％至30％。草的木质素含量是干重的2-8％，在生长季节会变动。除了提供硬度，木质素通过使细胞壁疏水性和水不透性而协助在植物中的水输送。
在细胞成长和膨胀停止后，次生细胞壁形成。不像初生细胞壁，次生细胞壁能采用高度特异化的结构和成分。例如，木质部细胞(例如在木材上发现的那些细胞)具有由木质素强化的加厚的次级细胞。
蔗糖(一种二糖)可由蔗糖合成酶(SuSy)(可能是在维管系统中的主要的蔗糖剪切酶)剪切为UDP-葡萄糖和果糖，或者可由插入酶插入葡萄糖和果糖((Koch2004)。因此，果糖注定是会成为一种通过剪切蔗糖产生的最丰富的单糖。
虽然UDP-葡萄糖是立即可用于纤维素合成，游离的果糖必须首先由六聚糖激酶(HXK)或果糖激酶(FRK)来磷酸化，用于进一步的代谢。在缺乏HXK或FRK时，积聚的果糖会导致SuSy活性的反馈抑制，降低蔗糖剪切(Schaffer与Petreikov1997a)。HXK和FRK是由它们的底物特异性和亲和性来区分的(Granot2007)。HXK可使葡萄糖和果糖磷酸化，但它与果糖的亲和性是比它与葡萄糖的亲和性低两个级别，也比FRK与果糖的亲和性低两个级别。因此，果糖倾向于首先由FRK磷酸化(Granot2007)。
FRK和SuSy存在于已检验的所有植物中，它们可能是在植物中必须有的。它们存在于多年生植物和一年生植物、裸子植物和被子植物、双子叶植物和单子叶植物，树木、灌木和草，也存在于已研究的所有农作物中。例如，它们存在于山杨、甜菜、棉花、番茄、马铃薯、黄豆、大麦、鳄梨、菠菜、百合、山茶、豌豆、玉米、水稻、瓜、拟南芥中。论文Gorenetal.2011中披露，蔗糖合成酶存在于多种物种中(见Gorenetal.2011中的图2、表2以及附录图1)。
番茄这种物种具有四种FRK基因，即FRK1-4，它们都已经被克隆和特征化((Daietal.2002,Damari-Weissleretal.2006,Damari-Weissleretal.2009,Germanetal.2004,Germanetal.2003,Granot2007,Odanakaetal.2002)。FRK1、FRK2和FRK3是在受检的所有植物部分中都表达的(Germanetal.,2004)，而FRK4是只在雄蕊中表达(Germanetal.2002)。如上所述，FRK2和FRK3酶表现为底物抑制。它们是由它们自身的底物果糖所抑制的，当果糖的浓度超过1mM(Daietal.1997,Germanetal.,Granot2004,Petreikovetal.2001)。另一方面，FRK1活性是不被果糖所抑制的。
蔗糖合成酶(SuSy)将蔗糖剪切为UDP-葡萄糖和果糖，该酶是在维管组织中主要的蔗糖剪切酶。番茄SuSy蛋白的Westernblot分析显示，沿着番茄茎的发育轴，SuSy表达量是主要地与在茎的木质部组织中的蛋白质成梯度性增加(Gorenetal.2011)。SuSy1是番茄植物中的主要SuSy基因，它与FRK2是在维管组织中共表达的。
类似于FRK2，SuSy活性也被果糖抑制(产物抑制或反馈抑制的现象)，因此，由SuSy从剪切蔗糖而释放的果糖会抑制SuSy活性。结果，分配用于维管和木质部发育的蔗糖的量是受到积聚的果糖所抑制的。
番茄FRK2(LeFRK2)是在大多数组织中表达的主要果糖激酶基因，包括茎、根和叶(Germanetal.,2004,Germanetal.,2002,Kanayamaetal.1997,Kanayamaetal.1998)。为研究LeFRK2在番茄植物中的重要性，申请人以前以LeFRK2反义抑制或共抑制培育和分析转基因番茄植物(Daiatal.,2002,Germanetal.,2003)。这些反义植物表现出生长抑制，数天后幼叶枯萎。三元接枝实验中，反义中间砧代替一段野生型茎，该实验显示，反义中间砧是足以抑制生长，并导致叶枯萎，暗示LeFRK2对于茎正常功能化是必要的。而且，在反义植物的茎中，活跃木质部的积累区是小于在野生型植物的茎部的积累区，这暗示LeFRK2对于茎木质部发育是必要的。分析表明，LeFRK2的抑制会导致维管细胞尺寸的显著减少，并显示出纤维成熟。在LeFRK2-反义植物的茎中的木质部管束是窄于在野生型植物的木质部管束，并具有更薄的次生细胞壁。虽然形成层产生圆形的次生管束，这些管束在木质部成熟的早期阶段会变形。然后，在茎、根和叶中的水传导会减少，这暗示LeFRK2影响在整个维管系统中的木质部发育。LeFRK2的抑制也会减少筛管部(韧皮部)的长度和宽度。
申请人已经发现，果糖激酶(FRKs)(果糖磷酸化酶)是调节引导向木材发育的糖量的主要酶。植物具有几种FRK同工酶，它们具有不同的细胞间定位和生化特性。采用FRK和SuSy的蔗糖代谢具有末端效应，即纤维素和木质素(细胞壁聚合物)产量通过它在碳分配上的效应而增加。FRK的过量表达或者FRK和SuSy的同时过量表达会导致增强细胞壁聚合物的沉积。
因此存在这样的需求以有效利用调节植物细胞壁合成和发育的基因。FRKs单独或结合SuSy可被用于增加在商业化植物(特别是用于生物质生成的树木和植物)中纤维素、细胞壁和木材生产。
技术实现要素：
本发明涉及转基因植物，它们呈现出增强的植物生长和增加的植物细胞壁。已经证实，FRK的表达增加以及SuSy与FRK的共表达增加都会加速蔗糖剪切和将糖类分配到维管和木质部发育，导致增厚的次生细胞壁。
在一个具体实施方式中，提供了工程化导入过量表达果糖激酶(FRKs)的转基因植物。本发明所述的FRK转基因植物始终表现出增强的植物生长速度和增加的生物质和细胞壁特性。
在另一个具体实施方式中，提供了工程化同时导入过量表达的果糖激酶(FRKs)和蔗糖合成酶(SUS)。本发明所述的FRK+SUS双转基因植物表现出增强的植物生长速度和增加的生物质和细胞壁特性。根据本发明所述，表现出这样的增强的细胞壁生长表现型特性的转基因植物是以几个单独的植物物种来产生的，采用多种转化方法、不同的表达质粒和启动子，以及来自许多物种的外源转基因序列。
申请人已经确认，果糖激酶(FRK)的增强表达是直接影响植物生长速度的增加，以及生物质和细胞壁含量的增加。本发明的这个方面在这里通过在几种物种中FRK的过量表达来做出示例性说明，这些物种包括：番茄、桉树，它们已经表达出重组FRK，并确认具有FRK活性。
本发明还提供了同时表达编码FRK的核苷酸(FRK转基因)和编码蔗糖合成酶SuSy(SuSy转基因)的转基因植物。这两种转基因在这种“双转基因”植物中的表达导致生长增强效应，正如这些植物所表现的。还提供了产生这样的生长增强的转基因植物的方法。
通过优先增加磷酸化糖类浓度(例如，在木质部组织)，本发明所述的转基因植物能在更短的期间内产生更高的总体产量，因此可向农业提供广范围的农作物的增强的产量。本发明所述的转基因植物的增强的生长特性是通过将附加的FRK和SuSy导入植物中而获得的。
在一个具体实施方式中，本发明提供了包括编码FRK的核苷酸和编码SuSy的核苷酸的转基因植物，其中每个所述核苷酸是可操作地连接到植物启动子。在特定的实施例中，所述FRK是FRK1。在另一个特定实施例中，第一核苷酸(FRK转基因)编码具有选自以下的氨基酸序列的多肽：(a)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:3；以及(b)与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:3的任意一个序列有至少40％相同的氨基酸序列，且具有FRK活性。在另一个特定实施例中，第二核苷酸(SuSy转基因)编码具有选自以下的氨基酸序列的多肽：(a)SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:17、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；以及(b)与SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:17、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的任意一个序列有至少40％相同的氨基酸序列。在一些具体实施方式中，FRK和SuSy转基因是被转导进入植物的基因组。本发明所述的转基因植物可以是单子叶或双子叶植物。本发明所述的转基因植物可以是树。
本发明的范围也包括本发明所述的转基因植物的任何传代的子代，所述子代包括编码FRK(FRK转基因)的核苷酸以及编码SuSy(SuSy转基因)的核苷酸。本发明也包括本发明所述的转基因植物的任何传代的种子，所述种子包括所述FRK转基因以及所述SuSy转基因。当与类似的野生型或未转化植物相比，本发明所述的转基因植物可显示一种或多种增强的生长特性，包括但不限于：增加的生长速度、生物质产量、细胞壁含量，也会显示增加的FRK和/或SuSy活性水平，和/或增加的磷酸化果糖水平。
本发明还提供了产生所述的转基因植物的方法以及它们的种子，包括产生具有以下特性的植物的方法：增强的生长特性、增加的生物质产量和增加的细胞壁含量。
附图说明
所附的附图在这里引入并作为说明书的一部分，显示了本发明的非限制性的具体实施方式，并与相应的描述结合解释本发明的原理。
在这些附图中：
图1显示了用于转化的FRK1&2和SuSy质粒。
图2显示了果糖活性检测方案。
图3显示了在野生型和不同转基因桉树株内的FRK2磷酸化活性。
图4A和图4B显示了以番红固绿染色的桉树茎的交叉区段在显微镜下图像。
图4C和图4D显示了在木质部区域和总茎部区域之间的比率。
图5A显示了在野生型(对照)、正义-FRK2植物和反义-FRK2植物的FRK2活性。
图5B显示了在野生型(对照)、正义-FRK2植物(正义)和反义-FRK2植物(反义)的细胞壁成分的百分率。
图6显示了在35S::FRK2桉树茎相比对照植物的增加的细胞壁含量的百分率。
具体实施方式
除非另有定义，这里所采用的所有技术、标记和其他科学词汇的术语都是指具有本发明所述领域的技术人员通常所知的含义。在一些例子中，具有通常理解的含义的术语是在这里被定义以澄清和/或作为参考，而这里包括的这样的定义不必然是被构成表示与本领域所理解的本质的区别。这里描述的或参考的技术和方法可采用本领域技术人员所熟知的传统方法来得以很好的理解和普通的应用，例如，描述在以下书籍中的广泛应用的分子克隆方法学：Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual3rd.edition(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.；CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausbeletal.,eds.,JohnWiley&Sons,Inc.2001；TransgenicPlants:MethodsandProtocols(LeandroPenak,ed.,HumanaPress,1.sup.stedition,2004)；以及AgrobacteriumProtocols(Wan,ed.,HumanaPress,2.sup.ndedition,2006)。视情况，这些方法涉及采用商业化可用的试剂盒和试剂，它们是根据生产商所定义的手册和/或参数来进行操作的，除非另有说明。
术语“FRK多核苷酸”和“FRK核苷酸”和“编码FRK的核苷酸”在这里可替换使用，它们是指编码果糖激酶蛋白的基因的全长或部分长度的多核苷酸序列，参与催化果糖的磷酸化，且包括翻译(编码)和不翻译序列的多核苷酸，以及它们的补充物。术语“FRK编码序列”是指转录和编码FRK蛋白的基因的部分。
“FRK转基因”是包括FRK多核苷酸的核苷酸分子，它是外源的赋予转基因植物、植物胚或子代、它们的器官或种子，使它们包含该核苷酸分子，或者它是外源的赋予原种植物、植物胚或子代、它们的器官或种子，产生包含FRK多核苷酸的转基因植物。
术语“SuSy多核苷酸”和“SuSy核苷酸”和“编码SuSy的核苷酸”在这里可替换使用，它们是指编码蔗糖合成酶蛋白的基因的全长或部分长度的多核苷酸序列，包括翻译(编码)和不翻译序列的多核苷酸，以及它们的补充物。术语“SuSy编码序列”是指转录和编码SuSy蛋白的基因的部分。
“SuSy转基因”是包含SuSy多核苷酸的核苷酸分子，它是外源的赋予转基因植物、植物胚或子代、它们的器官或种子，使它们包含该核苷酸分子，或者它是外源的赋予原种植物、植物胚或子代、它们的器官或种子，产生包含SuSy多核苷酸的转基因植物。
在本发明所述的包含FRK或SuSy多核苷酸的转基因植物和转化细胞的传代中，本领域技术人员可认识到：所插入的多核苷酸序列不需要是相同的，也可以仅是“基本上等同”于它所衍生的基因的序列，或者具有相同的酶活性，正如下面进一步定义的。术语“FRK或SuSy多核苷酸”特别包括这样的基本上相同的变体。类似地，本领域技术人员可认识到：因为密码子简并性，大量的多核苷酸序列可编码相同的多肽，且所有这样的多核苷酸序列都被认为是包括在术语“FRK或SuSy多核苷酸”中。此外，该术语特别包括那些与这里所公开的FRK或SuSy多核苷酸基本上相同的序列(正如下面所描述的)，这些多核苷酸编码野生型FRK或SuSy多核苷酸的成熟体的多肽，或者编码维持FRK或SuSy多核苷酸的功能的多肽(例如，来源于FRK或SuSy多核苷酸的氨基酸的保持置换)。因此，术语“FRK或SuSy多核苷酸”也包括这样的基本上等同的变体。
当关于核苷酸的部分来使用时，术语“外源”是指该核苷酸包括两个或多个序列，它们是在自然界中相同的关系中互相不能找到的。例如，核苷酸通常是重组产生的，具有来自不相关的基因的两个或多个序列，被排列为产生新功能的核苷酸，例如，编码来自一个来源的蛋白的核苷酸，以及编码来自另一个来源的多肽的核苷酸。
无论FRK或SuSy的“过量表达”是指任意mRNA表达，该表达是比相应的内源基因的常规表达水平更高。“更高”可以是任意百分比，达到一定程度，该增加时统计学显著的。
特定FRK蛋白的术语“功能性变体”是指具有比特定FRK蛋白少于100％相同的氨基酸序列的蛋白，它表现果糖磷酸化活性。
特定SuSy蛋白的术语“功能性变体”是指具有比特定SuSy蛋白少于100％相同的氨基酸序列的蛋白，它表现为将蔗糖独立剪切为UDP-葡萄糖和果糖。
转化植物的“FRK增加活性”是指从转化植物提取的每个蛋白单位的果糖磷酸化活性是比对照的非转化植物更高。“更高”可以是任意百分比，达到一定程度，该增加时统计学显著的。
转化植物的“SuSy增加活性”是指从转化植物提取的每个蛋白单位的蔗糖剪切活性是比对照的非转化植物更高。“更高”可以是任意百分比，达到一定程度，该增加时统计学显著的。
在本文的两个或多个核苷酸或多肽序列中，术语“相同”或百分比“相同”是指两个或多个序列是相同的或者具有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(例如，当比较时，约40％相同，优选50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同于特定的区域，且排列用于对比较窗口的最大符合，或采用序列比较算法测定的指定区域，或通过手动对齐和目测检查测定的区域。这个定义也是指测试序列的补充，它具有大量序列或大量补充，当测试序列具有与参考序列基本上相同的序列时。这个定义也指测试序列的补充，它具有大量序列或大量补充，当测试序列具有与参考序列基本上相同的序列时。
需要重视的是，来自不同植物的FRK可以有少于50％相同，但仍具有FRK活性。
当序列相同的百分比是被用于与多肽比较时，需要认识到：不相同的残基部分经常是由于保守氨基酸置换而不同，其中，氨基酸残基是被置换为其他具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基，因此，不会改变该多肽的功能特性。当保守替换导致序列不同时，序列相同的百分比可以向上调整为该置换的正确的天然保守。
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与之相比较。当采用序列比较算法时，将测试序列和参考序列都输入计算机，指定序列坐标，必要时，指定序列算法程序参数。可采用默认程序参数，或可指定替换的参数。然后，该序列比较算法将基于程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列相同百分比。
这里所采用的“比较窗口”是指包括选自以下范围的任意一段连续的位置：从20到600，通常约50到约200，更通常约100到约150，其中，序列可以与同样数量的连续位置的参考序列进行比较，当这两个序列以最佳方式对齐之后。对齐序列用于比较的方法是本领域所熟知的。可采用最佳的对齐序列进行比较的方法，例如，通过Smith&Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482所述的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,1988,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444的相似性检索法，通过这些算法的计算机化实施(在WisconsinGenetics软件包中的GAP,BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,Wis.)，或者通过人工对齐和目测检查(例如，参见MolecularBiology(Ausubeletal.,eds.1995supplement)中的CurrentProtocols)。
算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，适合用于确定序列相同百分率和序列相似度，它们分别被描述在Altschuletal.,1977,Nuc.AcidsRes.25:3389-3402和Altschuletal.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410。使用BLAST和BLAST2.0算法时，通常采用这里所述的默认参数，以确定对于本发明所述的核苷酸和蛋白质的序列相同百分比。用于运行BLAST分析的软件可通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的出版物获得。这个算法涉及：首先通过识别在查询序列中短字长W来确定高得分序列对(HSPs)，当与在数据库序列中相同长度的字对齐时，其匹配或满足某一正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschuletal.，见前)。这些初始邻域字命中作为用来启动搜索以找到含有它们的HSPs的种子。这些字命中沿着每个序列向两个方向延伸直到累积对准得分可被增加。对于核苷酸序列，累计得分是采用参数M(对于一对匹配残基的奖励得分)和N(对于不匹配残基的罚分；通常<0)来计算的。对于氨基酸序列，采用得分矩阵来计算累计得分。当以下情形时，字命中在每个方向的延伸会停止：累积对准得分从其最大获得值下降量X；累积得分趋于零或以下，这是由于一个或多个负得分残基排列的累积；或其中一个序列到达端点时。BLAST算法参数W、T以及X确定对准的灵敏度和速度。BLAST程序(对于核苷酸序列)采用字长(W)为11、BL0SUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))对准(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4以及两种链的对比作为缺省值。
包含FRK多核苷酸基因组DNA或cDNA可以在标准Southernblot中被识别，在严格条件下采用这里所揭示的FRK多核苷酸序列。对于这个目的，对于这样的杂交的合适的严格条件是包括：40％甲酰胺缓冲液，1MNaCl，37℃的1％SDS，以及至少以0.2×SSC在至少约50℃(通常约55℃至约60℃)洗至少一次20分钟，或等同的条件。正杂交是至少两次背景。本领域普通技术人员将清楚地认识到：替代的杂交和洗涤条件可被用于提供相似性趋势的条件。
申请人已经说明：在转化异源植物中果糖激酶基因的过量表达会导致增加的果糖磷酸化速度和增加的生长特征。包括FRK编码序列的转基因在转基因桉树植物的过量表达也会导致增加的果糖磷酸化。这些转基因植物也长得比野生型植物更快。类似地，在采用番茄植物进行的初级研究中(参见实施例4)，以番茄FRK转基因的番茄植物显示出显著增强的生长速率、开花以及结种产量，相对于野生型对照植物来说。
本发明还提供了产生转基因植物的方法，该植物具有增强的生长和其他农业上的特性。在一个具体实施例中，提供了一种产生转基因植物的方法，该植物具有增加的细胞壁含量和其他农业上的特性，该方法包括：将表达载体导入植物细胞，该表达载体包含编码FRK转基因的核苷酸分子，在合适的启动子的控制下，能驱动该转基因的表达，以致产生转化的植物细胞，并获得表达编码的FRK的转基因植物。在另一个实施例中，提供了另一种产生转基因植物的方法，该植物具有增强的生长和其他农业上特性，该方法包括：将一个或多个核苷酸结构或表达载体导入植物细胞，该核苷酸结构或表达载体包含编码FRK转基因和SuSy转基因的核苷酸分子，在一个或多个合适的启动子的控制下(以及，可选地，其他调控因子)，能驱动这些转基因的表达，以致产生转化的植物细胞，并获得表达FRK和SuSy转基因的转基因植物。
转基因结构/表达质粒
为了产生本发明所述的转基因植物，期望转基因的基因编码序列必须被插入到核苷酸结构(在这里可替代地称为“表达质粒、表达载体、表达构造或可表达的遗传结构”)中，它能在转化的植物细胞中引导转基因序列的表达。携带感兴趣的转基因的这样的核苷酸结构可采用本领域已知的大量方法而导入一个或多个植物细胞，这些方法包括但不限于：农杆菌介导的转化、电穿孔、DNA轰击或基因枪途径、微注射，以及通过采用多种基于DNA的质粒，例如根癌农杆菌和毛根农杆菌或其他二元质粒。一旦被导入转化的植物细胞，该核苷酸结构可引导插入的转基因(例如FRK)的表达，以暂时或稳定的方式进行表达。稳定的表达是优选的，并通过采用植物转化质粒来获得，它们能引导转基因结构的染色体整合。一旦植物细胞已经被成功转化，它可被培养为产生转基因植物。
适用于驱动在转化植物中插入的基因的组成型或导入型表达的大量表达质粒都是已知的。此外，多种临时表达质粒和表达系统也是已知的。为实现更大范围，合适的表达质粒被选择用于特定的基因转化方法。广泛地说，用于产生转基因植物的典型植物表达质粒将包括：在启动子的表达调控下的感兴趣的转基因，用于协助转化体筛选的选择性标记，以及转录终止序列。
更特别地，用于产生本发明所述的转基因植物的核苷酸结构的基础元件是：合适的启动子，能引导在转化植物中转基因的功能性表达；转基因(即FRK编码序列)，可操作地连接到启动子；优选地，合适的转录终止序列(也就是，胭脂碱合成酶基因终止子)，可操作地连接到转基因，某些有用于控制转基因表达的其他元件，以及一个或多个选择性标记基因，适用于筛选想要的转基因产物(即抗生素抗性基因)。
虽然根癌农杆菌是用于产生转基因植物的首要的转化系统，但也有许多设计用于农杆菌转化的质粒。为了稳定转化，农杆菌系统采用“二元”质粒，它允许质体在E.coli和农杆菌之间穿梭，通常包含一个或多个选择性标记以找回转化植物(Hellensetal.,2000,Technicalfocus:AguidetoAgrobacteriumbinaryTivectors.TrendsPlantSci5:446-451)。用于农杆菌转化系统的二元质粒通常包括：T-DNA边界、多克隆位点、对于大肠杆菌和根癌农杆菌的复制功能，以及选择性标记和报告基因。
转录终止子
在优选的具体实施例中，3'转录终止序列是被插入转基因的下游，以便引导转录的终止和使得mRNA转录物能正确地多腺苷酸化。合适的转录终止子是那些植物中已知功能的终止子，包括但不限于：根癌农杆菌的胭脂碱合成酶(NOS)基因和章鱼碱合成酶(OCS)基因、来自章鱼碱合成酶基因的T7转录物、来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制物I或II基因的3'端、CaMV35S终止子、tml终止子和豌豆rbcSE9终止子。此外，也可采用基因自身的转录终止子。
选择性标记
选择性标记通常包括在转基因表达质粒中，以便提供用于筛选转化体的手段。虽然多种类型的标记是可用的，但通常使用多种负选择标记，包括那些赋予筛选试剂抗性即抑制或杀死非转化细胞的标记，例如，赋予对抗生素(卡那霉素、庆大霉素、anamycin、潮霉素和潮霉素B)抗性的基因，或者对除草剂(磺酰脲、gulfosinate、草丁膦、草甘膦)抗体的基因。可筛选标记包括：例如，编码β-葡糖苷酸酶的基因(Jefferson,1987,PlantMol.Biol.Rep5:387-405)、编码荧光素酶的基因(Owetal.,1986,Science234:856-859)以及多种编码参与生长或控制花青素苷色素的蛋白的基因(例如参见美国专利第6,573,432号)。E.coli葡糖苷酸酶基因(gus、gusA或uidA)已经成为在植物转基因中广泛使用的选择标记，大概是由于葡糖苷酸酶的稳定性、高敏感度和容易检测(例如，采用荧光法、分光光度法、多种组织化学方法)。而且，在多数高等植物品种中没有可检测的葡糖苷酸酶。
从转化植物细胞、组织或器官再生个别植物的方法是已知的，都被描述用于多种植物物种。
作为一个例子，转化的植株(来源于转化的细胞或组织)是被培养在根许可生长培养基中，该培养基补充添加用于转化方法的选择性试剂(也就是，与诸如卡拉霉素的抗生素)。一旦生根，转化植株被转移到泥土中，使其生长到成熟。一旦开花，成熟的植物优选是自花授粉(自我受精)，最终产生的种子被收获，用于繁殖下一代。
为了使转基因植物可被用于繁殖下一代(例如，T1、T2等)，采用首代或次代转化体的自我授粉，或者通过代或次代转化体与其他植物(转化的或未转化的植物)的交叉授粉。相互交叉是这样做的，以致每株植物作为一个交叉组的雄性，而每株植物作为另一个交叉组的雌性。在成熟植物生长阶段期间，通常检验这些植物的生长表型等等(参见后面的章节)。
生长增强型转录植物的选择
通常采用标准的方法来选择、筛选和特征化转基因植物。本发明所述的优选的转基因植物将显现一个或多种表型特征，例如增强的生长和/或其他期望的农业特性。转基因植物通常是在选择性压力下再生的，以便在产生后代转基因植物之前选择转化体。此外，所采用的选择性压力可被应用于T0期之外，以便确保期望的转基因表达结构或载体的存在。
T0转化植物细胞、愈伤组织、组织或植物可通过遗传成分的选择或筛选而被识别和分离，和/或由包含在用于转化的转基因表达结构的标记基因编码的表型特征的选择或筛选而被识别和分离。例如，可通过潜在转化植物、组织或细胞在培养基中的生长来进行选择，该培养基包含抑制量的抗生素或除草剂，能对转化的遗传结构赋予抗性。此外，转化的植物细胞、组织和植物可通过标记基因的活性筛选而被识别(也就是β-葡糖苷酸酶)，它可存在于转基因表达结构中。
多种物理和生化方法可被应用于鉴别包含期望的转基因表达结构的植物，正如所熟知的方法。这些方法的例子包括：用于识别转基因、转基因表达结构或它们的元件的Southernblot(DNA印迹法)分析或多种核苷酸扩增方法(即PCR)，Northernblotting(RNA印迹法)，S1RNase保护法，用于检测和确定RNA转录物的反转录PCR(RT-PCR)扩增，以及蛋白凝胶电泳，Westernblotting(蛋白质印迹法)，免疫沉淀法，酶联免疫法，酶活性法和可被用于鉴别由转基因编码和表达的蛋白质的类似方法。
还需要注意的是，FRK和SySy酶活性测试是本领域技术人员的常规工作。这样的测试可被应用于人工植物，以便检验该植物是否表达天然FRK或SySy。
在另一个途径，基因、蛋白和/或代谢化合物的表达水平是已知的可由在目标植物中的转基因表达而被调控。在本发明的一个具体实施例中，磷酸化的果糖的增加水平可被用于筛选期望的转化体，正如在实施例中所举例说明的。类似地，FRK的增加水平(果糖磷酸化)和/或SuSy活性(UDP依赖蔗糖剪切)可被测定，正如在实施例中所举例说明的。
用于果糖激酶1和2(FRK1和FRK2)和蔗糖合成酶(SuSy)的克隆和转化进入植物的启动子
FRK1(SeqID.#2)和FRK2(SeqID.#3和4)的过量表达可以单独进行或者与SuSy(SeqID.#1)一起进行，或者与由本发明人分离(Gorenetal.,2011)的四种SuSy基因(SUS1-4SeqIDs#5-8)的任意之一进行，或者与任意其他FRK和SuSy基因进行。表达方案可包括：限制这些基因的表达至特定发育阶段，例如次生细胞壁发育，或限制至特定组织，例如木质部和维管或形成层组织单独，或在所有植物部分组成地过量表达这些基因。可通过发育特异性启动子来在特定发育阶段表达基因。发育启动子，例如仅在次级壁增厚和木质部组织发育期间表达的启动子，可以是：CesA7启动子(Boscaetal.2006)(SeqID#9)、PAL2启动子(Hattonetal.1995)(SeqID#10)、4CL-1启动子(Hauffeetal.1991)(SeqID#11)、FRA8启动子(Zhongetal.2005)(SeqID#12)以及DOT1启动子(Petrickaetal.2008)(SeqID#13)。
为获得在木质部发育阶段的表达，编码SuSy蛋白的核苷酸与编码FRK1或其他FRK蛋白的核苷酸是被分别融合到PAL2启动子和4CL-1启动子，以使得在植物中这两个蛋白的共表达能在发育阶段可控制。可选择地，SuSy和FRK1的组成型过量表达是通过将这些基因分别融合到SvBv启动子(SeqID#14)和CaMV35S启动子(SeqID#15)而获得的。可选地，FRK单独或SuSy单独或两者共同表达可在组成型启动子CaMV35S。
启动子的选择可取决于几种因素，包括但不限于：效率、可选性、诱导能力、所需的表达水平，和/或优先细胞或组织表达。这是本领域技术人员的一个常规问题，即通过恰当地选择和定位启动子和其他与序列有关的调控区域以调节序列的表达。可被采用的启动子的例子是本领域所熟知的。一些合适的启动子仅启动转录，或主要在特定细胞类型中启动转录。用于在植物基因组DNA中识别和特征化启动子区的方法，例如描述在以下文献：Jordano,etal.,PlantCell1:855-866,1989；Bustos,etal.,PlantCell1:839-854,1989；Green,etal.,EMBOJ.7:4035-4044,1988；Meieretal.,PlantCell3:309-316,1991；以及Zhangetal.,PlantPhysiology110:1069-1079,1996。
可被采用的启动子包括存在于植物基因组中的启动子，也包括来自其他来源的启动子。示例性的启动子包括：在根癌农杆菌的致瘤质粒上携带的胭脂碱合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子，和来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，例如参见在美国专利第5,164,316号和第5,322,938号(在此引入作为参考文件)所描述的启动子。来源于植物基因的非限制性示例的启动子是描述在：美国专利第5,641,876号，它描述了一种稻米动蛋白启动子；美国专利第7,151,204号，它描述了一种玉米叶绿体醛缩酶启动子和一种玉米醛缩酶(FDA)启动子；以及美国专利申请公告号2003/0131377，它描述了一种玉米烟酰胺合成酶启动子(每篇专利文献都在此引入作为参考文献)。
附加的可被采用的启动子的例子包括：核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，例如来自美洲落叶松(Larixlaricina)的RbcS启动子；松树cab6启动子(Yamamotoetal.,PlantCellPhysiol.35:773-778,1994)；来自小麦的Cab-1基因启动子(Fejesetal.,PlantMol.Biol.15:921-932,1990)；来自菠菜的CAB-1启动子(Lubberstedtetal.,PlantPhysiol.104:997-1006,1994)；来自稻米的cab1R启动子(Luanetal.,PlantCell4:971-981,1992)；来自玉米的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子(Matsuokaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:9586-9590,1993)；烟草Lhcb1*2启动子(Cerdanetal.,PlantMol.Biol.33:245-255,1997)；拟南芥SUC2蔗糖-H+转运体启动子(Truernitetal.,Planta196:564-570,1995)；以及来自菠菜的类囊体膜蛋白启动子(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab和rbcS)。附加的启动子可被用于驱动在茎、叶和绿色组织中的基因转录，描述在公开号为2007/0006346的美国专利申请中，这里以该文的全文引入作为参考。附加的启动子导致在植物绿色组织中优先表达，包括来自以下基因的启动子：拟南芥核酮糖1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小的亚单位(Fischhoffetal.,PlantMol.Biol.20:81-93,1992)；醛缩酶和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)(Taniguchietal.,PlantCellPhysiol.41(1):42-48,2000)。
在一些具体实施方式中，这些启动子可被改变为包含一个或多个增强子，以协助提高基因表达。可被用于推进基因表达的增强子的例子是本领域所熟知的。增强子通常是在启动子转录起点的5'发现，在真核细胞中发现，但经常可被插入编码序列的上游(5')或下游(3')。在一些例子中，这些5'增强元件是内含子。增强子的非限制性例子包括：稻米肌动蛋白1和稻米肌动蛋白2基因的5'内含子(参见美国专利第5,641,876号)、玉米乙醇脱氢酶基因内含子、玉米热冲击蛋白70基因内含子(参见美国专利第5,593,874号)以及玉米缩小1基因内含子。
在一些具体实施方式中，DNA结构或质粒也可包含来自病毒的非翻译先导序列。可促进转录的非翻译先导序列的非限制性例子包括来自以下的序列：烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)以及苜蓿花叶病毒(AMV)(例如参见Gallieetal.,Nucl.AcidsRes.15:8693-8711,1987；Skuzeskietal.,PlantMol.Biol.15:65-79,1990)。附加的示例性先导序列包括：小核糖核酸病毒先导子，例如，EMCV先导子(脑心肌炎病毒5'非编码区)(Elroy-Steinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:6126-6130,1989)；马铃薯Y病毒组先导子，例如，TEV先导子(烟草蚀刻病毒)；MDMV先导子(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)先导子(Macejaketal.,Nature353:90-94,1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译先导子(AMVRNA4)(Joblingetal.,Nature325:622-625,1987)；烟草花叶病毒(TMV)先导子(Gallieetal.,Mol.Biol.RNA,pages237-256,1989)；以及玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)先导子(Lommeletal.,Virology81:382-385,1991)。还可参见Lommeletal.,Virology81:382-385,1991。
在一些具体实施方式中，DNA结构或质粒也可包含3'元件，即可包含多腺苷酸化信号和/或位点。熟知的3'元件包括来自以下的元件：根瘤农杆菌基因，例如nos3'、tml3'、tmr3'、tins3'、ocs3'、tr73'，例如参见美国专利第6,090,627号所描述的3'元件，该专利在此引入作为参考。3'元件也可来源于植物基因，例如，3'元件可来自：小麦(Triticumaesevitum)热冲击蛋白17(Hsp173')、小麦泛素基因、小麦果糖-1,6-二磷酸酶基因；稻米谷蛋白基因、稻米乳酸脱氢酶基因，以及稻米β-微管蛋白基因，所有这些都描述在公开号为2002/0192813的美国专利申请中(在此引入作为参考)；豌豆(Pisumsativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs3')，以及来自在宿主植物内的基因的3'元件。在一些具体实施方式中，3'元件也可包括合适的转录终止子，例如CAMV35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子，以及豌豆rbcSE9终止子。
在一些具体实施方式中，DNA结构或质粒也可包括可诱导的启动子。可诱导的启动子驱动转录以响应外部刺激，例如化学试剂或环境刺激。例如，可诱导的启动子能授予转录以响应激素，例如赤霉酸或乙烯，或响应光或干旱。可诱导的启动子的非限制性例子是描述在Guoetal.,PlantJ.34:383-392,2003以及Chenetal.,PlantJ.36:731-40,2003。
转化方法
用于植物的转化技术是本领域所熟知的，包括：基于农杆菌的技术(例如参见美国专利第5,635,055号、第5,824,877号、第5,591,616号、第5,981,840号以及第6,384,301号)以及不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术包括：直接由原生质或细胞摄入外源遗传材料。这可通过以下方式来实现：聚乙二醇(PEG)，或电穿孔介导的摄入(例如参见美国专利第5,384,253号)，粒子轰击介导的传递(例如参见美国专利第5,015,580号、第5,550,318号、第5,538,880号、第6,160,208号、第6,399,861号以及第6,403,865号)，原生质转化(例如参见美国专利第5,508,184号)或微注射。这些技术的非限制性例子是描述在Paszkowskietal.,EMBOJ.3:2717-2722,1984；Potrykusetal.,Mol.Gen.Genet.199:169-177,1985；Reichetal.,Biotechnology4:1001-1004,1986；以及Kleinetal.,Nature327:70-73,1987。所有这些都在此被引入作为参考文献。
采用农杆菌的转化也已经被描述(例如参见WO94/00977和美国专利第5,591,616号，每篇文献都在此引入作为参考)。在每个例子中，转化的细胞都采用本领域已知的常规技术而再生为整株植物。许多质粒可用于采用根瘤农杆菌的转化中。这些质粒通常携带至少一种T-DNA边界序列，并包括诸如pBIN19的质粒(Bevan,Nucl.AciesRes.11:369,1984)。二元质粒pCIB10包含：编码卡拉霉素抗性的基因，用于在植物中筛选；以及T-DNA右和左边界序列；并引入来自宽宿主范围质粒pRK252的序列，使得它能在E.coli和农杆菌中都能复制(Rothsteinetal.,Gene53:153-161,1987)。由重组子农杆菌对目标植物物种的转化通常包括：农杆菌与来自植物的外植体共培养，遵循本领域所熟知的协议。转化的组织是在选择性培养基上再生的，该培养基带有存在于二元质粒T-DNA边界之间的抗生物素或除草剂抗性标记。
另一种以基因转化植物细胞的方法包括：推进在植物组织和细胞中的惰性或生物活性颗粒。在美国专利第4,945,050号、第5,036,006号和第5,100,792号中揭示了这种技术(每篇专利文献在此引入作为参考)。总体上，这种方法包括：在有效于穿透细胞的外表面的条件下，推进在细胞中的惰性或生物活性颗粒。在以下文献中描述了粒子轰击的示例性方法以获得植物细胞的转化：Gordon-Kammetal.,PlantCell2:603-618,1990；Frommetal.,Biotechnology8:833-839,1990；WO93/07278；以及Kozieletal.,Biotechnology11:194-200,1993。采用粒子轰击的转化质体的示例性方法是描述在：Svabetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:913-917,1993；Svabetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:8526-8530,1990；McBrideetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:7301-7305,1994；Dayetal.,PlantBiotech.J.9:540-553,2011。
如上所述，植物细胞也可采用PEG或电穿孔法来转化。采用PEG或电穿孔法来转化植物细胞的技术的非限制性例子是描述在EP0292435、EP0392225和WO93/07278中。
暂时转化也可被用于在植物细胞或植物中表达目标基因。植物组织的暂时转化的非限制性例子包括：叶渗透、真空渗透、农杆菌感染，或以DNA包衣颗粒轰击目标组织。
植物
在一些具体实施方式中，转基因植物是单子叶或双子叶植物。单子叶转基因植物的例子包括：例如，草地早熟禾(蓝草，Poa)、饲用牧草(例如，高羊茅和黑麦草)、温带草(例如剪股颖)以及谷类(例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱和玉米)。双子叶转基因植物的例子包括：例如，烟草、豆类(例如，羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、黄豆和大豆)，以及十字花科植物(芸苔科家族)(例如花椰菜和菜花)。因此，这里所提供的转基因植物包括广范围的植物，包括但不限于来自以下属的物种：腰果、花生、芦笋、颠茄、燕麦、油菜、柑橘、西瓜、辣椒、红花、茯苓、咖啡树、黄瓜、南瓜、胡萝卜、油棕、草莓、大豆、棉花、向日葵、萱草、大麦、天仙子、莴苣、亚麻、黑麦草、羽扇豆、番茄、苹果、木薯、马约拉纳、苜蓿、烟草、油橄榄、水稻、糜子、狼尾草、鳄梨、菜豆、黄连木、豌豆、梨、桃、萝卜、蓖麻、黑麦、千里光、白芥、千里光、高粱、可可树、胡芦、小麦、蚕豆、葡萄、豇豆和玉米。
在一些具体实施方式中，转基因植物是树或灌木(例如，桉树或灌木)。桉树的非限制性例子包括但不限于以下物种和它们的交叉：E.botryoides,E.bridgesiana,E.camaldulensis,E.cinerea,E.globule,E.grandis,E.gunii,E.nicholii,E.pulverulenta,E.robusta,E.rudis,E.saligna,E.Tereticornis,E.Urophilla,E.viminalis,E.dunnii和前述任意物种的交叉杂交体，特别是EucalyptusgrandisandEucalyptusurophylla的杂交体。流行的种是：P.deltoides,P.tremula,P.alba,P.nigra(euramericana),P.nigra(canadensis),P.tremula,P.trichocarpa,P.rouleauiana,P.balsamifera,P.Maximowiczii以及它们的交叉。松树：属＝Pinus。
分离的核苷酸分子
本发明的一个方面涉及编码FRK或SuSy蛋白的分离的核苷酸分子，以及足够用作杂交探针以识别FRK或SuSy的核苷酸片断——编码核苷酸(例如FRK或SuSymRNA)和片断，用作CCP核苷酸分子的扩增或突变检测的PCR引物。正如这里所采用的，术语“核苷酸分子”是指包括：DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)以及RNA分子(例如mRNA)以及采用核苷酸类似物所产生的该DNA或RNA的类似物。核苷酸分子可以是单链或双链分子，但优选是双链分子。
一个“分离的”核苷酸分子是一个从其他核苷酸分子中分离的分子，它们是存在于核苷酸的天然来源中。例如，关于基因组DNA，术语“分离的”包括：从染色体分离的核苷酸分子，基因组DNA是天然关联于染色体。优选地，一个“分离的”核苷酸是游离的序列，天然地位于在有机体的基因组DNA的核苷酸的侧面(也就是，位于核苷酸的5'和3'端的序列)，该核苷酸是来自该有机体。例如，在多种具体实施方式中，分离的FRK或SuSy核苷酸分子可包括至少约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核酸序列，它天然地位于细胞的基因组DNA的核苷酸分子的侧面，该核苷酸是来自该细胞。而且，诸如cDNA分子等“分离的”核苷酸分子可以是基本上游离的其他细胞材料，或培养基，当通过重组技术产生时，或者是基本上游离的化学先导物或其他化学物质，当通过化学合成时。
本发明所述的核苷酸分子，例如编码氨基酸序列为SEQIDNO:1-8或其一部分的核苷酸分子，可采用这里所提供的序列信息和标准分子生物学技术而被分离。例如，采用氨基酸序列为SEQIDNO:1-8的全部或一部分，作为杂交探针，FRK或SuSy核苷酸分子可采用标准杂交和克隆技术而被分离(例如，描述在Sambrook,J.,Fritsh,E.F.,andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd,ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989)。
而且，编码氨基酸序列为SEQIDNO:1-8的全部或一部分的核苷酸可通过PCR技术而被分离，采用合成的分别基于SEQIDNO:1-8序列所设计的寡核苷酸引物。
本发明所述的核苷酸可采用cDNA、mRNA或可选的基因组DNA作为模板来被扩增，采用根据标准PCR扩增技术的合适的寡核苷酸引物。这样扩增的核苷酸可被克隆进入合适的质粒，并通过DNA序列分析来特征化。而且，对应于CCP核酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术来制备，例如采用自动DNA合成仪。
在另一个优选实施方式中，本发明所述的分离的核苷酸分子包括：编码与序列NO:1-8(例如，核苷酸的全长)或者这些核苷酸序列的任意一部分具有至少约40％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,98％或更多相同的核苷酸序列。
众所周知，过分实验是不需要用于引物或探针的这种分离。这些是琐碎的方法，它们可被用于在任意物种中的每种基因，一旦人们知道某个基因的序列并选择参考基因，或只采用核糖体RNA(rRNA)作为参考。用于本发明的这样的引物的例子是：用于LeFRK1(GenBank登录号U64817)的CTCCGTTACATATCTGATCCTT和GACAGCATTGAAGTCACCTT；用于LeFRK2(GenBank登录号U64818)的TTGTTGGTGCCCTTCTAACCA和ACGATGTTTCTATGCTCCTCCCT；用于LeFRK4(GenBank登录号AY099454)的GACATTTACATGGATGAGAAGAAA和GCTGTGGCACCATCCAATATTT。番茄肌动蛋白基因(GenBank登录号U60482)用作表达规范化的看家基因。用于肌动蛋白基因的引物是CACCATTGGGTCTGAGCGAT和GGGCGACAACCTTGATCTTC。用于LeFRK3的引物是GTGGTGCATTGACCGTGATGandGGTCGGATGGATATTATGCAACTG。同样，对于LeFRK3，番茄肌动蛋白基因(GenBank登录号U60482)用作表达规范化的对照看家基因。蔗糖合成酶的引物是被提供在Planta(2011)233:1011–1023，在此引入作为参考。在Gorenetal.2011的附录表1中显示了SlSUS1、SlSUS3和SlSUS4的引物的PCR、RT-PCR和测序。
果糖激酶的活性测定
果糖激酶的活性是基于六碳糖激酶(六碳糖磷酸化)来测定，正如在SchafferandPetreikov1997b所描述的。果糖激酶的活性是通过酶联测定，它是基于果糖(Fru)的磷酸化，通过果糖激酶获得果糖-6-磷酸(Fru-6-P)。然后由葡糖磷酸异构酶(PGI)将Fru-6-P转变为葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)。以NAD依赖的Glc-6-P脱氢酶(G6PDH)将Glc-6-P氧化为6-磷-D-葡萄糖酸(PGA)，G6PDH将NAD+还原为NADH，可通过340nm读数连续监测(图2)。
蔗糖合成酶(SuSy)活性测定
二糖剪切酶的活性是体外测定的，在生理pH水平在剪切的方向上测定。将来自每个样品的粗蛋白提取液(100μl)加入到400μl的反应缓冲液(0.2MSuc或Tre,60mM柠檬酸/磷酸缓冲液，pH＝5或pH＝7)中，在三个独立的试管中：一个是pH5，另一个是pH7，第三个是pH7并加入25μl的100mMUDP。反应管置于37℃温育1小时，然后加入萨姆纳试剂，将这些管置于100℃放置5分钟。第四管是作为每个样品的对照管，它具有粗提取液，然后加入萨姆纳试剂。在这些管中的还原单糖是通过550nm吸收度来测量的，对照管作为每个样品的空白。酸转化酶活性是从pH＝5的管计算的，碱转化酶活性是从pH＝7的管计算的，而来自UDP管和pH＝7管的差异是SuSy活性。对于在每个样品中的蛋白量来使活性标准化。
需要注意的是，另一种SuSy酶活性，蔗糖剪切半反应的测定是基于Chourey1981所述的方法。从植物叶中提取的蛋白，通过添加小量的SiO2颗粒到0.5g叶片，用研棒磨碎，加入1.5ml的提取缓冲液(50mMHEPES-KOHpH7.5,10mMMgCl2,1mMEDTA,2mMDTT,0.1％v/vTritonX-100,10％v/v甘油和蛋白酶抑制剂)。样品以15,000g离心20分钟。
木材密度测量
木片的基础密度是根据标准TAPPI方法(Grundelius1990)来确定。
基础密度是被定义为木材样品的烤干重与它的绿色体积之间的比率。
D＝M/V
其中：
D＝基础密度，kg/m3。
M＝烤干重，kg。
V＝以周围的水平衡的木材样品的绿色体积，m3。
木片是从树的底部切削的，并泡水72小时。在水排干后，测定木片的绿色体积两次，然后通过将木片浸渍在水浴中，在将它们小心擦掉后，将它们置于一个平衡上。
V＝(C-B)/e
其中：
V＝以周围的水平衡的木材样品的绿色体积，m3。
C＝当浸没在水中时，木片和样品篮的重量，g。
B＝浸没在水中时，空的样品篮的重量，g。
e＝样品篮周围的水的密度，g/cm3。
随着绿色体积的确定，在105℃干燥直至恒定重量。
计算基础密度。
纤维和管道特征
野生型和转基因样品是用于以下特征的分析：
ο纤维长度
ο纤维宽度
ο纤维腔的直径
ο壁厚度
ο管道长度
ο管道直径
ο管道面积
将木片浸在热乙酸/硝酸溶液(5:1)中软化6小时。在浸软之后，在水中彻底清洗这些样品，水合纤维材料洗至少24小时，然后搅拌至完全纤维分离。
对于每个木材样品，以摄像显微镜测量100根纤维和100管道，并以图形分析仪进行分析。
细胞壁成分：
用于分析细胞壁成分的经典“湿”方法是由K.,G.H.,andJ.,V.-S.P.(1970)所教导的。参见ForageFiberanalyses.USDAAgriculturalHandbookNo.379.Washington,DC:USDA；andAOAC.1990。参见OfficialMethodsofAnalysis.15thed.Assoc.Off.Anal.Chem.,Arlington,VA。特别地，“湿”方法的样品是：
粗纤维-AOAC978.10——这种方法仅测量纤维素和一些木质素；ADF-AOAC973.18——ADF测量纤维素和所有木质素；以及NDF-AOAC2002.04。NDF是对所有纤维的更完全的测量，它测量所有的纤维素、木质素和半纤维素。
实施例
为了举例说明本发明，包括以下的实施例。然后，需要明确的是，这些例子不会限制本发明，而是仅作为实现本发明的方法的建议。
为了实施本发明的一些具体实施方式，构建了五个转化质粒，它们显示在图1中：
质粒#1-CaMV35S启动子::FRK1。
质粒#2-CaMV35S启动子::FRK2。
质粒#3-CaMV35S启动子::FRK2(番茄)。
质粒#4-CaMV35S启动子::FRK1_SvBv启动子::SuSy。
质粒#54CL-1启动子::FRK1_PAL2启动子::SuSy.
实施例1——在FRK转化的桉树中增加的生长
如图1所示的质粒2作为指定的质粒被克隆进入质体pBI121(GenBank:AF485783.1)，含CaMV35S启动子和NOS终止子。转基因的桉树植物是被设计为表达外源番茄FRK2蛋白(登录号：Z12823；SEQIDNO.4)。电转化农杆菌EAH105，在卡拉霉素平板(100μg/ml)筛选48小时，然后用于植物转化。采用在Prakashetal.,InVitroCellDevBiol.-Plant45:429-434,2009中描述的方法来进行桉树转化。简单地说，在包含3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂的MS(MurashigeandSkoog)基础盐培养基上，在体外进行桉树射击转化。
植物生长和生理测定
纯合子和杂合子转基因和野生型植物是在温室中生长6个月。每月测量冠层的高度和口径。通过测量每株转基因植物从根冠部到茎顶部的长度来确定所述高度。在实验的末段测量干重。
植物蛋白提取
在液氮中粉碎桉树叶(1克)，以4ml提取液(3mMDIECA,1％(w/v)PVPP,2.5mMDTT和1mMPMSF，pH7.6)搅匀。将混合物冰浴60分钟，然后以13,000×g在4℃离心30分钟。将上清转到80％硫酸铵进行饱和，再冰浴15分钟。以12,000×g(4℃)离心后，以0.5ml清洗缓冲液(50mMHEPES,1mMEDTA,1mMDTT,pH7.5)重悬沉淀，在G-25fineSephadex层析柱(55mm×11mm)去盐，得到蛋白粗提取液，用于后续酶分析。
基因表达分析
基因组DNA是从独立的转基因植物中提取的，并通过PCR分析FRK2的存在。正独立T0植物用于FRK2的表达水平分析。通过EZ-RNA试剂盒(BiologicalIndustriesCo.,BeitHaemek以色列)根据生产商手册从200mg新鲜叶片中分离全部RNA。以无RNase的DNase处理该RNA，通过反转录反应进行第一链cDNA合成。通过实时PCR采用引物FRK2-F(5'-TTGTTGGTGCCCTTCTAACCA-3')和FRK2-R(5'-ACGATGTTTCTATGCTCCTCCCT-3')来分析FRK2mRNA水平。对于内部对照基因组蛋白H4，采用引物P915'-GAAGCGGCACAGAAAGGTCC-3'和P925'-CCGAAGCCATACAGGGTCCT3'，使FRK2基因表达标准化。
在桉树中FRK活性测定
果糖激酶活性是通过分光光度计测定的，采用酶联免疫法对蛋白质提取物进行测定。PGI酶将F6P转变为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，G6P-脱氢酶将氢从G6P传递到NAD，将其转变为NADH。通过分光光度计读取NADH的量。测定是在0.5ml反应混合物中进行的，反应混合物包括：100μl的粗蛋白提取液、30mMHEPES(pH7.6)、9mMKCl,1MMgCl2,1mMATP,1mMNAD,0.5单位PGI(III型)、0.5单位NAD-依赖G-6-PDH。该反应是在加入1或10mM果糖后启动的。在37℃和A340nm检测酶活性(mg/ml)，连续监控酶活性(PetreikovandSchaffer,1997a)。
如上所述，35S::FRK2结构是通过农杆菌介导的转化而被导入桉树，共获得14个转化株。为了评估转基因的活性，发明人通过从新鲜组织提取蛋白质并测定活性来分析了FRK2蛋白。第10株显示了最高的FRK2活性，其后是13A、7A和5A，正如在植物转化实验中预期的，其中，定位效应、复制量和其他因素提供了变化的结果(图3)。图3显示了FRK2磷酸化活性。在野生型和不同的转基因桉树株中测量了酶活性，以10mM果糖为对照。野生型10A株显示了最强的活性。
在桉树中FRK2的过量表达会增加在茎内的木质部区域
35S::FRK2在维管发育中的效果是通过计算在交叉区段的相对木质部区域来分析的，交叉区段是取自成熟的和年幼的桉树茎。虽然15A和19A株显示了木质部区域类似于野生型，包括在成熟的和年幼的茎，但是10A株在成熟茎中显示了比野生型显著更高的比率(图4)。因此，35S::FRK2表达有利于木质部形成。
图4显示了35S::FRK2在桉树维管系统的效果。在子图A和B中，桉树茎的交叉区段在显微镜下由番红固绿染色。外部和内部的木质部边界是用红色标记并具有木质部(黄色双箭头)。虽然外部边界指示了形成层片段，内部边界包围髓部(p)。在木质部和总茎区域之间的比率，35S::FRK2茎(B)比野生型(A)更高。在成熟茎(C)和年幼茎(D)中，计算木质部区域和总茎区域之间的比率，用于野生型和转基因桉树株的交叉区段。10A株在成熟茎(C)显示了木质部区域和总茎区域之间的最高比率，但在年幼茎(D)中未显示。
解剖特征——组织学分析
为了分析维管系统的结构，在FAA(1.85％福尔马林、5％冰醋酸、63％乙醇)中固定茎组织，通过乙醇系列(70％、80％、90％和100％，每次30分钟)进行脱水，石蜡包埋，用切片机(LeicaRM2245)切段，用番红-O/固绿染色(Johansen1940)。在LeicaIM1000显微镜下观察切片材料，以CCD照相机DC2000(德国Leica)摄取数码图像。
碳分配分析
检测木质素/纤维素/半纤维素比淀粉在转化植物中的相对量。参照之前描述的Fosteretal.(Fosteretal.2010)获得细胞壁材料(CWM)，方法上有小的修改；成熟开花期茎被风干、粉碎，并通过40孔筛分。在70％乙醇中清洗颗粒，以12,000g漩涡离心10分钟。以氯仿：甲醇(1∶1，v/v)清洗沉淀，以12,000g漩涡离心10分钟。以丙酮清洗沉淀，再以12,000g离心10分钟，风干和称重。通过温育干燥的沉淀去除淀粉含量。将干燥的粉末在80℃置于NaAc缓冲液(100mMpH5)中20分钟，制成胶状，通过淀粉酶和普鲁兰酶共育去除淀粉。以水和丙酮清洗沉淀，然后风干。
细胞壁分析
纤维素是在细胞壁(CWM)中量化的，根据Updegraff方法(Updegraff1969)，通过Saeman水解法水解得到的纤维素，并通过anthrone法定量(ScottJrandMelvin1953)。
CWM的单糖成分是通过两阶段硫酸水解(Sluiteretal.2004)来确定的。在中和后，在水解产物中的单糖(阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖)是在80℃在HPLC系统上分析的，该HPLC系统装备有PhenomenexRezexRPM-单糖Pb2+(8％)柱(300mm×7.80mm)，采用HPLC级水的梯度流动相通过RI检测器来测定。茎的木质素含量是通过乙酰溴方法(Fukushima和Hatfield2001)测定的。木质素成分是通过硫代酸解法确定的，根据之前描述的方法(Robinson和Mansfield2009)。最终产物被三甲基硅烷化，然后由GC/MS鉴定。
图6显示了通过在桉树中FRK2表达后细胞壁成分的变化。在三种不同转基因株13A、15A和19A中，相对于野生型计算细胞壁成分百分比。
实施例2——在FRK&SuSy双转基因桉树的增加的生长
转基因桉树植物是在实施例1中产生的，但具有图1所示的质粒4，克隆了在SEQIDNO.18所示的序列。在这个表达质粒中，果糖激酶1是在35S启动子下，SuSy是在SvBv启动子下。AGS终止子被用于果糖激酶，NOS终止子被用于SuSy。果糖激酶1(FRK1)的来源是番茄，优化用于桉树表达。SuSy的来源是棉花，优化用于桉树表达。通过实时PCR分析FRK1和SuSymRNA水平，采用以下引物：对于FRK1，引物为：正向：CTCCGTTACATATCTGATCCTT；反向：GACAGCATTGAAGTCACCTT(GenBank登录号U64817)。对于桉树优化的来自棉花的SuSy，引物为：正向：TTGCATTGGCCGTGAG；反向：GCAAGTCCTCAATTTCTGGG。
蔗糖合成酶的活性测定
二糖剪切酶的活性是体外测定的，在生理pH水平在剪切的方向上测定，如上所述。用于蔗糖剪切的反应混合物包括：64μmolesMES缓冲液(pH6.0)、125μmoles蔗糖、0.5μmoles尿苷二磷酸(UDP)和来自多个表型的1、5或10μl的粗酶制备液，在瓶内的总体积为0.4ml。瓶内含有相同的内容，但在对照中缺UDP。这些反应管在30℃水浴温育15分钟，加入DNS终止反应，测定减少的糖。
可溶性碳水化合物和淀粉
通过在5ml的80％乙醇中重悬茎片段，从中提取糖类，在80℃水浴60分钟。重复这个过程两次。合并乙醇溶液，连续通风情况下在40℃完全蒸发。风干的糖类溶解于1ml蒸馏水，并存储于-80℃。通过HPLC确定蔗糖、果糖和葡萄糖含量。该HPLC系统包括ShimadzuLC10AT溶剂传送系统，通过ShimadzuRID10A折光率检测器来检测。在Alltech700CH碳水化合物柱(Alltech,Deer-Weld,IL，美国)上进行分离，保持在90℃，Xow速率为0.5ml/min，根据制造商的建议进行。乙醇不溶性残留物被用于确定在茎的嫁接部分的淀粉浓度。通过以6ml水温育和剪切样品，对淀粉进行消化，然后加入包含200单元淀粉葡糖苷酶的4ml缓冲液，在55℃温育过夜(Dinaretal.1983)。释放的葡萄糖的总量是采用萨姆纳试剂确定的。在550nm测定光密度(Damari-Weissler,Rachamilevitch,Aloni,German,Cohen,Zwieniecki,MicheleHolbrookandGranot2009)。
实施例3——FRK和SuSy共转化桉树的增加生长
转基因桉树植物是在实施例2中生产的，但带有如图1所示的质粒5，克隆了在SEQIDNO.19所示的序列。在这个表达质粒中，果糖激酶1是在4CL-1启动子下，SuSy是在PAL2启动子下。AGS终止子被用于果糖激酶，NOS终止子被用于SuSy。果糖激酶1(FRK1)的来源是番茄，优化用于桉树表达。SuSy的来源是棉花，优化用于桉树表达。通过如实施例2所示的引物进行实时PCR来分析FRK1和SuSymRNA水平。
实施例4——在FRK转化番茄中细胞壁含量的增加
番茄转化和转基因株选择
在花椰菜花叶病毒35(CMV35)启动子的控制下，FRK2基因以正义和反义方向被导入二元质粒pBI121，该质粒包含新霉素磷酸转移酶II基因(nptII)作为选择性标记。在一种番茄(L.esculentum)株MP-1上进行转化，该植物株已知具有高转化效率，正如在McCormick(McCormick1991)所述。通过PCR和DNA凝胶印迹法分析T0和T1独立转基因植物，表明FRK2基因存在和复制量。FRK2基因半合子和纯合子植物是在T1种子中鉴别的，伴随nptII的卡拉霉素抗性隔离分析，该抗性基因连接到FRK2基因。FK3和FK29这两种植物，从15种具有正义FRK2的独立的T0再生植物中分选出，是基于它们在叶片和果实中FRK2的高表达和活性水平而选择的。在反义FRK2的转化植物中，在12种独立转化体中只有1种植物被选出(FK-3a,5)，它显示显著的LeFRK2表达和活性((German,Dai,Matsevitz,Hanael,Petreikov,Bernstein,Ioffe,Shahak,Schaffer和Granot2003)。
FRK2改变表达影响细胞壁含量
为了检测FRK2基因的抑制或增加的表达对于细胞壁的效应，申请人分析了在FRK2-反义转基因番茄植物的茎内的全部细胞壁和细胞壁成分(纤维素、半纤维素和木质素)，具有比野生型植物更低的FRK2表达和活性，且表达马铃薯FRK2(登录号：Z12823)的转基因番茄植物在正义(编码)方向(FRK2-正义植物)显示具有比野生型植物更高的FRK2表达和活性(图5A)。
细胞壁含量分析
在茎中的总细胞壁、纤维素和木质素含量是直接相关于FRK2表达和活性。将收获的3克植物材料在65℃烘干，粉碎，过1-mm网筛。由AOAC(1995)程序第989.03号分析该样品，其中，NDF和ADF使根据Goering和VanSoest(1970)方法测定。(IVDMD)的体外干物质消化率是根据Tilley和Terry(1963)方法来评估的。
虽然FRK2-反义植物具有比野生型茎低20％的总细胞壁和纤维素含量，正义植物在茎内具有显著更高的细胞壁、纤维素和木质素含量(图5B)。
图5显示了由FRK2表达的细胞壁成分的变化。在图5A中显示在野生型(对照)、正义FRK2植物和反义FRK2植物的FRK2活性。在植物蛋白提取物中测定酶活性。在图5B中显示在野生型(对照)、正义FRK2植物(正义)和反义FRK2植物(反义)的细胞壁成分百分比。
这里所引用的所有出版物、专利和专利申请都引入作为参考文献，即使每个单独的出版物或专利申请时特别的，单独也被引入作为参考。
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