本发明属于植物组织培养方法，具体为一种野生山桃稠李组织培养方法。
背景技术：
山桃稠李正名为斑叶稠李(学名：Padusmaackii(Rupr.)Kom)小乔木，高4-10m。叶椭圆形，菱状卵形、稀有矩圆状倒卵形，长4-8cm，叶缘具不规则带腺锐锯齿，背面沿中脉被短柔毛，被紫褐色腺体。总状花序，基部无叶。花白色，多花密集；花柱和雄蕊近等长。果近球形，径5-7mm，紫褐色。花期4-5月，果期6-10月。润肥沃的砂质壤土上生长良好，萌蘖力强，病虫害少。喜光也耐阴，抗寒力较强，怕积水涝洼，不耐干旱瘠薄，在湿润肥沃的砂质壤土上生长良好，萌蘖力强，病虫害少。随着对园林绿化树种种类以及质量的需求与日俱增，山桃稠李的发展前景十分广阔。黑龙江省林业科学研究所在2009年-2014年在黑龙江省内的林区进行了大量的调查，发现黑龙江省林区野生的山桃稠李具有良好的抗逆性，并且树干笔直，枝叶茂盛，花期果期都很长，是优良的园林绿化树种。2009年在黑龙江省哈尔滨市区，黑龙江省林业科学研究所苗圃进行了扦插繁殖，成活率非常低。所以，又进行了种子繁殖实验，成活率相对高些，但是，出苗率仍然很低，苗木成本非常高。而且，有性繁殖很难保存原生母本的优良特性。国内目前，针对黑龙江省林区的野生山桃稠李的组织培养还没有系统的研究。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明的目的在于设计提供一种野生山桃稠李的组织培养方法的技术方案，该方法采用不定芽增殖途径，经过不定芽增殖、壮苗、生根过程，直接建立试管苗再生体系，该方法操作简单，繁殖系数高，有效保存了野生山桃稠李的特异种质资源的母本遗传信息，为选育山桃稠李的新品系奠定基础。本发明的一种野生山桃稠李组织培养方法，它是按照以下步骤进行的：一、外植体的选取：外植体选取野外山桃稠李植株；二、外植体消毒：取带顶芽的侧芽作为外植体剪成4～5cm的带芽茎段，采用洗衣粉清洗干净，然后再用清水冲洗1～2h；置于超净工作台上用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0.1％升汞消毒8min，然后用无菌水冲洗3次；三、初代培养：将消毒外植体剪成1cm左右的茎段接入初代培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养30天；所述初代培养基由改良WPS培养基+浓度为1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；四、不定芽的增殖培养：将初代培养的带芽茎段接入增殖培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；所述增殖培养基由改良WPS+浓度为1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；五、壮苗培养：将在增殖培养基中培养至长度达到1cm以上的不定芽逐个切下，接入1/2改良WPS培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；六、生根培养：将壮苗培养基中的健康健壮的芽接入生根培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养30天；所述的生根培养基由1/4改良WPS培养基+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；所述的改良WPS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：所述的大量元素为：(1)浓度为400mg/L的硝酸铵、(2)浓度为190mg/L的硝酸钾、(3)浓度为170mg/L的磷酸二氢钾、(4)浓度为370mg/L的硫酸镁、(5)浓度为684mg/L的硝酸钙；所述的铁盐为：(1)浓度为27.85mg/L的硫酸亚铁、(2)浓度为37.28mg/L的乙二胺四乙酸盐；所述的微量元素为：(1)浓度为22.5mg/L的硫酸锰、(2)浓度为8.6mg/L的硫酸锌、(3)浓度为0.25mg/L的硫酸铜、(4)浓度为6.2mg/L的硼酸、(5)浓度为0.25mg/L的钼酸钠；所述的有机成分为：(1)浓度为0.1mg/L的盐酸硫胺素、(2)浓度为0.5mg/L的盐酸吡哆辛、(3)浓度为0.5mg/L的烟酸、(4)浓度为2.0mg/L的甘氨酸、(5)浓度为100mg/L的肌醇。本发明包含以下有益效果：采用本发明的方法带顶芽的侧芽萌发率高达82.8％，无菌萌发率达到61.3％，增殖系数达到4.89，生根率91.2％。本发明的方法能较好的保持母本的抗逆性和观赏性，大大缩短了育苗周期，5个月即可获得生根苗木，有效提高了山桃稠李的繁殖系数；与种子繁殖相比，组织培养可以有效的提供低成本的高观赏性的绿化苗木，能有效降低苗木成本，节省开支；与体胚发生组织培养方法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本发生变异的风险，能更好的保持母本的抗逆性和观赏性。具体实施方式具体实施方式一：本实施方式的一种野生山桃稠李组织培养方法，它是按照以下步骤进行的：一、外植体的选取：外植体选取野外山桃稠李植株；二、外植体消毒：取带顶芽的侧芽作为外植体剪成4～5cm的带芽茎段，采用洗衣粉清洗干净，然后再用清水冲洗1～2h；置于超净工作台上用体积百分含量为75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，再用质量百分含量为0.1％升汞消毒8min，然后用无菌水冲洗3次；三、初代培养：将消毒外植体剪成1cm左右的茎段接入初代培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养30天；所述初代培养基由改良WPS培养基+浓度为1.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；四、不定芽的增殖培养：将初代培养的带芽茎段接入增殖培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；所述增殖培养基由改良WPS+浓度为1.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；五、壮苗培养：将在增殖培养基中培养至长度达到1cm以上的不定芽逐个切下，接入1/2改良WPS培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养周期为40天；六、生根培养：将壮苗培养基中的健康健壮的芽接入生根培养基中培养，培养条件为：培养温度为20～24℃，光照强度为2000lx，光照时间每天12h，培养30天；所述的生根培养基由1/4改良WPS培养基+浓度为0.5mg/L的萘乙酸组成；所述的改良WPS培养基由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分组成：所述的大量元素为：(1)浓度为400mg/L的硝酸铵NH4NO3、(2)浓度为190mg/L的硝酸钾KNO3、(3)浓度为170mg/L的磷酸二氢钾KH2PO4、(4)浓度为370mg/L的硫酸镁MgSO4·7H2O和(5)浓度为684mg/L的硝酸钙Ca(NO3)2·4H2O；所述的铁盐为：(1)浓度为27.85mg/L的硫酸亚铁FeSO4·7H2O和(2)浓度为37.28mg/L的乙二胺四乙酸盐Na2EDTA；所述的微量元素为：(1)浓度为22.5mg/L的硫酸锰MnSO4·4H2O、(2)浓度为8.6mg/L的硫酸锌ZnSO4·7H2O、(3)浓度为0.25mg/L的硫酸铜CuSO4·5H2O、(4)浓度为6.2mg/L的硼酸H3BO3和(5)浓度为0.25mg/L的钼酸钠Na2MOO4·2H2O；所述的有机成分为：(1)浓度为0.1mg/L的盐酸硫胺素VB1、(2)浓度为0.5mg/L的盐酸吡哆辛VB6、(3)浓度为0.5mg/L的烟酸VB5、(4)浓度为2.0mg/L的甘氨酸和(5)浓度为100mg/L的肌醇。具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中选取野外山桃稠李植株是指：选取当年萌发的带顶芽的侧芽茎段为野外山桃稠李植株，将野外采集的山桃稠李植株置于低温保温箱里储存，备用。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中外植体消毒：将采集的小枝条去掉不用的部分，剪成4～5cm的带芽茎段，置于放有洗衣粉水的烧杯里，用纱布网将烧杯口套住，用手不断晃动烧杯5min，将烧杯用流水冲洗1～2h。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三、四和五中的培养基中分别加入浓度为20g/L蔗糖和浓度为6.5g/L琼脂，pH用氢氧化钠调节至6.0。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中所述的初代培养过程中进行预防褐化。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：进行预防褐化是指在第一次接种至培养瓶内后，每隔3天就换瓶一次，一共三次。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1/4改良WPS培养基是指大量元素加入量为权利要求1改良WPS培养基的1/4体积，微量元素、铁盐和有机成分与权利要求1改良WPS培养基一致。其它与具体实施方式一相同。具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：1/2改良WPS培养基是指大量元素加入量为权利要求1改良WPS培养基的1/2体积，微量元素、铁盐和有机成分与权利要求1改良WPS培养基一致。其它与具体实施方式一相同。本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。通过以下实施例验证本发明的有益效果：实施例11.实验材料与方法：(1)外植体采集：试验材料为2014年7月中旬采自黑龙江省哈尔滨市帽儿山的当年生带芽茎段。(2)外植体消毒:将采集的小枝条去掉不用的部分，剪成4-5cm的带芽茎段，置于放有洗衣粉水的烧杯里，用纱布网将烧杯口套住，用手不断晃动烧杯5min,将烧杯用流水冲洗1-2h。之后，在超净工作台上用75％的乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，放在无菌滤纸上风干，分别用0.1％升汞消毒4、6、8、10、12min，用无菌水冲洗5次，12d后统计污染率。(3)不定芽的诱导：分别取顶芽、侧芽和带顶芽的侧芽，经消毒后接种于MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的培养基中，每瓶接种一个茎段，每种组合接种60瓶，实验重复3次。16d天后统计萌发率，萌发率＝萌发数/未污染个数。(4)不定芽的增殖：选取生长情况良好的组培苗开展增殖培养的实验，采用2因素3水平的随机实验，基本培养基选用改良WPS，6-BA分别用0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，一共三个水平，NAA选用0.25mg/L，0.5mg/L，0.75mg/L，一共三个水平。一共9种组合，每种组合接种10瓶，每瓶3个组培苗，实验重复三次。40d后统计增殖情况和生长状况。增殖系数＝增殖苗数/接种苗数。(5)壮苗培养：以生长健壮的2cm以上的增殖苗为材料，放入改良WPS、1/2改良WPS、1/4改良WPS，1/6改良WPS，1/8改良WPS培养基中，培养40d。(6)生根培养:以生长健壮的2cm以上的壮苗为材料，采用2因素3水平完全随机设计，基本培养基选择改良WPS、1/2改良WPS、1/4改良WPS，1/6改良WPS，1/8改良WPS；激素选择NAA，分为0.5、1.0、1.5mg/L，3个水平。每个处理接种10瓶，每瓶3个增殖苗，实验重复3次。40d后统计生根率及生长情况。以上培养条件为:培养温度(22±2)℃，光照强度2000lx，光照时间每天12h。培养基均附加蔗糖20g/L、琼脂6.5g/L，pH值为6.0。(7)实验结果：表1不同的消毒方法对无菌体系的影响表2不同类型的芽对于诱导萌发的影响表3不同激素组合对于组培苗增殖的影响表4不同基本培养基对苗生长的影响表5不同基础培养基及激素组合对组培苗生根的影响本实例建立的植株再生体系，带顶芽的侧芽萌发率高达82.8％，无菌萌发率达到61.3％，增殖系数达到4.89，生根率91.2％。本发明的方法能较好的保持母本的抗逆性和观赏性，大大缩短了育苗周期，5个月即可获得生根苗木，有效提高了山桃稠李的繁殖系数；与种子繁殖相比，组织培养可以有效的提供低成本的高观赏性的绿化苗木，能有效降低苗木成本，节省开支；与体胚发生组织培养方法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本发生变异的风险，能更好的保持母本的抗逆性和观赏性。