本申请要求2014年6月6日提交的美国临时申请号62/008,934(其在此以其整体通过引用并入)的权益。发明领域本发明总体涉及表达昆虫抑制蛋白的植物的领域。具体而言，本发明涉及针对作物植物诸如茄科和柑橘植物的农业相关害虫(具体地半翅类吸汁害虫(hemipteroidsap-suckinginsectpests)，诸如亚洲柑橘木虱、非洲柑橘木虱、美洲柑橘木虱和马铃薯/番茄木虱(Bactericeracockerelli))表现出昆虫抑制活性的蛋白。发明背景木虱是通常在单一植物或几种相关植物上进食的小的韧皮部进食性昆虫。它们可以充当可以作为植物害虫发挥作用的不同微生物物种的载体。它们也被怀疑当它们进食时向植物物种递送毒素，引起发病。来自亚洲、非洲和美洲的柑橘木虱是在柑橘树的叶和茎上进食的小的害虫。这些木虱传播称为黄龙病(Huanglongbing,HLB)(也称为柑橘青果病)的细菌性疾病。所有柑橘和密切相关的物种是柑橘木虱昆虫和HLB病的易感宿主。在木虱在受感染的植物组织上进食之后，该细菌性疾病被木虱传播至健康树。一旦柑橘树被HLB感染，就无法治愈，且植物将最终死亡。目前预防该疾病杀死柑橘树的最好方法是阻止这些柑橘木虱。马铃薯/番茄木虱(Bactericeracockerelli)已经是茄科作物(包括马铃薯、番茄、胡椒和茄子)的长期害虫。其可以通过直接进食损害植物，怀疑递送植物毒素，并且还传播细菌病原体Liberibacterpsyllaurous和Liberibactersolanacearum。在马铃薯中，其据认为引起称为木虱黄斑(psyllidyellows)的全身性疾病，其包括生长减少、叶子变黄、新叶子直立、叶异常、节间缩短和增厚、节增大、空心块茎、过早衰老和早期植物死亡。在番茄中，叶子症状与马铃薯的症状相似，并且可以降低坐果(fruitset)、大小、质地(texture)和产量。马铃薯/番茄木虱和L.solanacearum的传播也已与马铃薯中的斑马片病相关，其引起萎缩、萎黄病、上部生长的肿胀节间、腋芽繁殖、空心块茎、脉管系统褐变、叶焦枯和过早植物死亡。已经使用不同的杀虫剂对抗马铃薯/番茄木虱，然而，最近在加利福尼亚的木虱种群中已经检测到对常见处理的一些抗性(Butler和Trumble,TerrestrialArthropodReviews,5,87-111,2012)。目前还没有将消除木虱和在柑橘果园或茄科作物田间内的病原体传播的风险的防治方法。抑制木虱侵染的方法将可能减缓疾病的传播并保持作物生产的经济可行性。鉴于这些问题，开发了本文所述的发明。发明概述我们已经发现，来自定殖于昆虫的多毛菌属(Hirsutella)真菌和来自葱属植物(洋葱科)的几种基因和本文描述的其他基因，当在转基因植物中表达时，可用于抑制木虱昆虫的进食。因此，本发明提供可用于保护植物免于由木虱引起的疾病(例如柑橘青果病和斑马片病)的经纯化的核酸分子、载体(诸如表达载体)、细胞、植物和植物组分、产物和方法。在一个方面，本发明的特征在于包括编码异源多肽的转基因的植物，所述多肽对表达所述多肽的植物赋予对半翅类吸汁害虫的抗性(如本文所述)。在优选实施方案中，所述昆虫是木虱，诸如亚洲柑橘木虱。在其他优选实施方案中，所述植物对木虱的侵染具有抗性。在还有其他优选实施方案中，所述植物对木虱的进食具有抗性。因此，本发明的特征在于对吸汁昆虫无吸引力的植物。在特别优选的实施方案中，所述植物是柑橘植物。因此，示例性植物包括芸香科的任何成员，包括但不限于橙、柠檬、酸橙和葡萄柚植物。优选地，所述转基因与用于表达多肽的调节序列(诸如异源调节序列)可操作连接，并且其中所述调节序列包括启动子(例如，组成型启动子或细胞特异性启动子，诸如在植物的韧皮部细胞或韧皮部组织中有活性的启动子)。示例性多肽与如本文所述的HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1实质上相同。在其他优选实施方案中，根据常规技术(如本文所述)堆叠编码所述多肽的多核苷酸。还考虑转基因植物或植物组分中的一种或多种多核苷酸的组合。表达此类多核苷酸的植物通常证明与对照植物相比增加的产量。在另一个方面，本发明的特征在于衍生自表达本文所述的任何多核苷酸的转基因植物的产物，其中所述产物包括可检测量的转基因或从所述多核苷酸表达的多肽。优选地，所述产物是柑橘产物或茄科植物产物。在又另一个方面，本发明的特征在于后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包括表达本文所述的一种或多种多核苷酸的转基因。在一些实施方案中，所述后代植物或种子包括赋予对除草剂的抗性的除草剂抗性基因。在另一个方面，本发明的特征在于与HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1(各自描述于本文中)具有实质同一性的多核苷酸，任选地其中所述多核苷酸与用于表达所述多肽的调节序列可操作连接，并且其中所述调节序列包括启动子。在另一个方面，本发明的特征在于表达构建体，其包括表达一种或多种多肽的多核苷酸，所述多肽对植物赋予对半翅类吸汁昆虫的抗性。示例性多核苷酸是与HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)、ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1具有实质同一性的那些。在其他优选实施方案中，所述多核苷酸与选自HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)、ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1的序列的至少20个连续核苷酸互补。在其他优选实施方案中，所述多核苷酸与异源调节序列诸如CaMV35S启动子、CaMV35S串联启动子、Shpx6b启动子、SUS1启动子或CsSUS1启动子可操作连接。在还有其他优选实施方案中，所述多核苷酸与nos-终止子可操作连接。在还有其他优选实施方案中，所述多核苷酸在植物的韧皮部组织中表达。在另一个方面，本发明的特征在于包括本文所述的多核苷酸或表达构建体中的一种或多种的植物细胞，植物或植物组分。具体而言，本发明的特征在于作为柑橘属的成员的植物，诸如甜橙(Citrussinensis)、甜橙L.Osbeck‘Hamlin’或甜橙L.Osbeck‘Valencia’。在又另一个方面，本发明的特征在于通过营养繁殖繁殖如本文所述的任何转基因植物(诸如柑橘和马铃薯)。在又另一个方面，本发明的特征在于衍生自包括本文所述的多核苷酸中的一种或多种的植物细胞、植物或植物组分的产物，其中所述产物包括可检测量的重组多核苷酸。在优选实施方案中，所述产物是柑橘产物或茄科产物，其可以包括但不限于柑橘果实、柑橘果汁和柑橘果汁浓缩物。在其他方面，本发明的特征在于防治半翅类吸汁昆虫的方法，所述方法包括将所述昆虫暴露于包括本文所述的多核苷酸中的一种或多种的植物细胞、植物或植物组分，其中所述植物细胞、植物或植物组分表达抑制昆虫(例如直接或间接)进食的多肽。通常，所述方法，例如，涉及使植物对木虱进食或侵染不太有吸引力。在另一个优选方面，本发明的特征在于使植物对柑橘青果病具有抗性的方法，所述方法包括以下步骤：将本文所述的多核苷酸中的一种或多种引入植物细胞；和从所述植物细胞再生表达昆虫抑制量的由所述多核苷酸编码的多肽的转基因植物；和任选地证明亚洲柑橘木虱抗性作为转基因柑橘植物或转基因柑橘植物组分的特性。再次，所述方法通常涉及使植物对木虱进食或侵染不太有吸引力。在又另一个优选方面，本发明的特征在于使植物对斑马片病和木虱黄斑具有抗性的方法，所述方法包括以下步骤：将本文所述的多核苷酸中的一种或多种引入植物细胞；和从所述植物细胞再生表达昆虫抑制量的由所述多核苷酸编码的多肽的转基因植物；和任选地证明马铃薯/番茄木虱抗性作为转基因茄科植物或转基因茄科植物组分的特性。在另一个方面，本发明的特征在于用于获得柑橘果汁的方法，所述方法通常涉及提供收获自表达赋予对半翅类吸汁害虫的抗性的多肽的植物的果实，并从植物诸如由此类植物提供的果实提取柑橘果汁。在优选实施方案中，从柑橘植物的果实诸如橙、柠檬、酸橙或葡萄柚提取果汁。在其他优选实施方案中，所述方法进一步涉及浓缩柑橘果汁。在还有其他优选实施方案中，所述方法进一步涉及强化柑橘果汁(例如，维生素和营养素硫胺素和钾，维生素D和钙)。此外，如果需要，所述方法进一步涉及强化柑橘果汁浓缩物。在还有其他方面，本发明的特征在于获得柑橘类果实诸如橙、柠檬、酸橙和葡萄柚的方法，所述方法涉及从表达赋予对半翅类吸汁昆虫的抗性的多肽的植物收获果实。“核酸分子”或“多核苷酸”意指具有两个或更多个共价键合的、天然存在或修饰的核苷酸的序列的分子，例如RNA或DNA。所述核酸分子可以是例如单链或双链的，并且可以包括修饰或未修饰的核苷酸，或其混合物或组合。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。“核酸片段”或“多核苷酸片段”意指核酸分子的连续区段。核酸区段的长度可以范围为至少一个碱基对(例如，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450个碱基对)直至核酸分子的全长。当核酸分子在本文中被称为具有多于一个核酸片段时，应当理解这些核酸片段可以占据核酸分子的非重叠部分。“序列同一性”(在比较核酸分子或核酸片段的序列与参考序列或比较多肽的氨基酸序列与参考序列的上下文中)意指，当核酸分子或核酸片段的全长序列与参考序列的全长最佳比对时，核酸分子或核酸片段与参考序列具有相同的序列或具有指定百分比的在参考序列内的对应位置处相同的核苷酸。在该上下文中，参考较长序列的长度计算两个序列之间相同的核苷酸的百分比。可以在DNA和DNA、RNA和RNA或DNA和RNA之间计算序列同一性。当在DNA和RNA之间计算序列同一性时，本领域充分理解，为了该计算的目的，胸苷残基等同于尿嘧啶残基。此外，本领域充分理解的是，如果反向互补序列与参考序列的百分比序列同一性大于正向序列的百分比序列同一性，则百分比序列同一性是前一量。例如，Needleman-Wunsch算法可以用于基于最佳总体比对来确定序列同一性。同样可以根据标准方法在多肽之间计算序列同一性。用于测定核酸序列同一性或多肽同一性的计算机程序(例如，蛋白blast)可以在例如欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute,EMBL-EBI)网站公开获得或使用在国家医学图书馆(NationalLibraryofMedicine)网站找到的BLAST®。“实质上相同”(在比较核酸分子或核酸片段的序列与参考序列或比较多肽的氨基酸序列与参考序列的上下文中)意指，所述序列具有至少85％(例如，至少85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％)的序列同一性，如使用上述方法所计算的。“对植物害虫的抗性”意指大于相对于对照植物(例如，非转基因植物)的抗性水平的转基因植物(或植物组分或细胞)中对害虫(例如，半翅类吸汁昆虫，诸如木虱，诸如亚洲柑橘木虱)的抗性水平。在一个实施方案中，转基因植物中对害虫的抗性水平比对照植物的抗性高至少5至10％(且优选20％、30％或40％)。在其他实施方案中，对害虫的抗性水平比对照植物高50％、高60％且更优选甚至高75％或90％；其中与对照植物相比高达100％的抗性是最优选的。使用常规方法测量抗性水平。例如，通过比较相比于对照叶的转基因叶对木虱的无吸引力性来测定对木虱的抗性水平。在另一个实例中，测定对木虱侵染的抗性水平。并且在仍另一个实例中，在转基因植物比对照植物中测定对木虱进食的抗性水平，作为确定表达异源多肽以便为植物赋予抗性的有效性的量度，如本文所述。“可操作连接”意指基因和调节序列以这样的方式连接，所述方式使得当适当分子(例如，转录激活蛋白)与调节序列结合时允许基因表达。“多肽”或“蛋白”意指任何氨基酸链，而无论长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。“植物细胞”意指由半透膜界定且含有质体的任何自我繁殖细胞。如果期望进一步繁殖，此类细胞还需要细胞壁。如本文所使用的植物细胞包括但不限于获得自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝、花粉和小孢子的任何细胞。“植物组分”意指获得自完整植物的部分、区段、插条、液体、纤维或器官。示例性植物组分包括但不限于种子、体细胞胚、树皮、叶、茎、花粉、根、枝、花、卷须、果实、接穗和根状茎、果汁和果汁浓缩物以及用于营养繁殖的任何植物部分。“转基因”意指通过人为插入细胞中并成为从该细胞发育的生物体的基因组的一部分的核酸分子(例如，DNA)的任何片段。此类转基因可以包括对转基因生物体部分或完全异源(即外源)的基因，或者可以代表与生物体的内源基因具有序列同一性的基因。“转基因的”意指包括通过人为插入细胞中并成为从该细胞发育的生物体的基因组的一部分的分离核酸分子(例如，DNA序列)的任何细胞。如本文所使用，转基因生物体通常是转基因植物，并且DNA(例如，转基因)通过人为插入核或质体基因组中。转基因植物可以含有本文所述的分离核酸分子中的一种或多种。如本文所讨论，已经鉴定、分离或工程改变和表征了几种多核苷酸，其可用于提供对木虱的抗性。因此，本发明为针对害虫保护植物提供了许多重要的进步和优点。例如，本发明有助于用于通过阻止害虫进食来针对植物害虫的植物中保护的有效和经济的方法。此类针对害虫的保护减少或尽可能减少传统化学实践(例如，施用杀细菌剂或杀虫剂或两者)的需求，所述传统化学实践通常由农民用于防治植物害虫的传播和提供针对致病害虫诸如亚洲柑橘木虱和马铃薯/番茄木虱的保护。此外，因为具有本文所述的多核苷酸中的一种或多种的植物对害虫及其疾病不太脆弱，所以本发明进一步提供增加的生产效率，以及改善农作物植物诸如柑橘作物植物和茄科植物的质量和产量。因此，本发明有助于产生高质量和高产量的基于柑橘的农产品，例如由害虫引起的斑点、瑕疵和污点减少(包括由于HLB导致的青果病减少)的果实、果汁以及作物；保质期增加和处理成本降低的农产品；以及用于农业，工业和商业目的的高质量和产量作物。此外，因为本发明减少针对植物害虫的化学保护的必要性，所以本发明有利于作物生长的环境。详述本申请描述了制备具有木虱害虫抗性的转基因植物或转基因植物组分；特别是，例如，阻止转基因柑橘植物或植物组分诸如但不限于‘Hamlin’或‘Valenicia’甜橙、番茄和马铃薯上木虱的进食或侵染。害虫抑制性多核苷酸和多肽与以下序列实质上相同的多核苷酸可用于生成具有对半翅类吸汁昆虫的抗性(诸如使植物或植物组分对例如木虱无吸引力)的转基因植物。可以设计合成的多核苷酸序列，使得它们将在植物中表达。用于合成植物基因以改善由合成的基因编码的蛋白的表达水平的各种标准方法是本领域已知的。此类方法通常涉及修饰外源转基因的结构基因序列，以使它们被植物更有效地转录、加工、翻译和表达。在植物中良好表达的基因的特征包括消除可以引起基因转录物的编码区中的不期望的内含子剪接或聚腺苷酸化的序列，同时实质性保留表达的多肽的氨基酸序列。1.多毛菌素(Hirsutellin)A(“HtA”)：来自真菌多毛菌的核糖体毒素基因a.“天然”b.多肽：c.“短”d.多肽：2ASAL：来自大头蒜(Alliumampeloprasum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：3.ASALR：来自玫瑰红葱(Alliumroseum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：4.ACA：来自洋葱变种aggregatum(Alliumcepavar.aggregatum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：5.ACT：来自韭菜(Alliumtuberosum)的凝集素基因a.天然：b.多肽：c.短：d.多肽：6.MpNPR1：参与苹果中的基础植物抗性的调节基因a.核苷酸序列：b.多肽序列：7.CsNPR1：参与柑橘中的基础植物抗性的调节基因根据标准方法分离和鉴定有用的CsNPR1序列。例如，使用E.Z.N.A.植物DNA提取试剂盒根据制造商的说明书(OmegaBio-Tek,Norcross,GA)从甜橙栽培种valencia(C.sinensiscv.valencia)(FourWindsGrowers,Winters,CA)提取基因组DNA。由于先前没有公开来自甜橙的CsNPR1序列，所以首先使用基于用来自Malusxdomestica的已知MpNPR1mRNA序列(GenBank登录号EU624123.1)进行的CLUSTAL比对设计的简并引物克隆包括编码序列的5'部分的基因组区域。将使用1μM最终浓度的引物CsNPR1degF1(tggctgtgactatagtgatgct)(SEQIDNO:21)和CsNPR1degR1(ccctaaccttctgatttgcacc)(SEQIDNO:22)以及GoTaqHotStartMastermix(Promega,Madison,WI)从甜橙基因组DNA扩增近似1800-bp片段。循环参数为95℃持续2分钟，35个循环的95℃持续30秒、50℃持续30秒、72℃持续1分钟，且最终72℃延伸5分钟。然后根据Liu等人(PlantMolBiolRep19:261-267,2001)实施基因组末端的5’快速扩增(RAGE)以克隆CsNPR1编码序列上游的区域。简而言之，使用OMEGASP植物DNAmidi试剂盒根据制造商的说明书(OmegaBio-Tek)从甜橙栽培种valencia叶提取基因组DNA，并使用最初设计为在CsNPR1编码序列的5'末端附近退火的引物进行PCR。使用基因步行策略进行性获得上游5'片段。然后将所有PCR产物克隆至测序载体诸如pGEM-Teasy(Promega)中。植物表达构建体用于在植物诸如茄科和柑橘植物中的表达盒的构建是充分确立的。表达盒是其中可操作连接各种启动子、编码和聚腺苷酸化序列的DNA构建体。一般而言，表达盒通常包含可操作连接至目标序列的启动子，所述目标序列可操作连接至聚腺苷酸化或终止子区域。在某些情况(包括但不限于转基因在植物中的表达)下，包括内含子序列也可能是有用的。当包括内含子序列时，其通常位于转基因的5'非翻译前导区。在某些情况下，在转基因中引入特定5'非翻译序列以增强转录物稳定性或促进转录物的有效翻译也可能是有用的。在本发明的实践中可以使用多种启动子。有用启动子的一个广泛类别被称为“组成型”启动子，因为它们在整个植物发育中在大多数植物器官中是有活性的。例如，所述启动子可以是病毒启动子诸如CaMV35S启动子。CaMV35S启动子在多种转化的植物组织和大多数植物器官(例如，愈伤组织、叶、种子和根)中有活性。CaMV35S启动子的增强或重复版本同样是特别有用的。其他有用的启动子是本领域已知的。在某些植物组织中有活性的启动子(即，组织特异性启动子)也可用于驱动本文公开的昆虫抑制性蛋白的表达。由于某些害虫诸如木虱是通常通过将它们的吻突插入宿主植物的维管组织而进食的吸汁昆虫，所以在转基因植物的维管组织中指导昆虫抑制性蛋白或其片段的表达的启动子在本发明的实践中是特别有用的。示例性韧皮部特异性启动子包括但不限于过氧化物酶基因启动子Shpx6b。其他有用的韧皮部优选启动子包括从蔗糖合酶1(SUS1)基因诸如玉米、烟草、柑橘、烟草或甘蔗分离的那些。来自李子(欧洲李栽培种改良法国李(PrunusdomesticaL.cv.ImprovedFrench))的示例性启动子区域显示如下。ATG(粗体)显示SUS1基因的起始密码子。下划线序列对应于用于下游研究以进行缺失构建体的引物(在1379、978和672个核苷酸的序列)。SEQIDNO:23中粗体斜体的序列对应于由网站PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)描述的赋予菜豆(Phaseolusvulgaris)中的木质部特异性的元件。又另一种有用的韧皮部特异性启动子是来自甜橙的蔗糖合酶-I启动子(CsSUS1p)(Singer等人,Planta234:623-637(2011))。转录增强子元件还可以与在植物细胞中有活性的任何启动子或与植物细胞中的活性需要增强子的任何基本启动子元件结合使用。转录增强子元件可以激活各种植物细胞中的转录，并且通常为100-200个碱基对长。增强子元件可以通过化学合成或通过从包括此类元件的调节元件分离来获得，并且可以包含含有有用的限制性酶位点以促进子序列操作的额外的侧翼核苷酸。增强子元件通常可以位于与启动子缔合的mRNA帽位点的5'的区域内，但也可以位于帽位点的3'的区域(即，在5'非翻译区、内含子或聚腺苷酸化位点的3'内)以提供可操作连接的基因的增加表达水平。此类增强子是本领域众所周知的。此外，5'非翻译前导序列可以可操作连接至植物表达盒中的目标编码序列。因此，所述植物表达盒可以含有一个或多个5'非翻译前导序列，其用于增加可操作连接的编码本文所述的任何多肽的核酸编码序列的表达。编码提供本文描述的任何多肽在亚细胞细胞器中的定位的肽的序列可以可操作连接至编码特定多肽的序列。因此，预期可操作连接至信号肽的多肽进入分泌途径，并且可以被细胞器诸如内质网保留或通过将适当的保留或靶向肽可操作连接至多肽的C-末端而靶向至液泡。液泡靶向肽以及用于靶向植物质体的肽的实例是本领域众所周知的。如上所示，目标多核苷酸序列还可以可操作连接至含有聚腺苷酸化信号的3'非翻译区。该聚腺苷酸化信号向RNA的3'末端添加聚腺苷酸序列。农杆菌肿瘤诱导(Ti)质粒胭脂碱合酶(NOS)基因3'和豌豆ssRUBISCOE9基因3'非翻译区含有聚腺苷酸信号，并且代表此类3'非翻译区的非限制性实例，其可用于本发明的实践中。应当理解，该组示例性聚腺苷酸化区域是非限制性的，并且本领域技术人员可以采用本文中未明确引用的其他聚腺苷酸化区域。任何上述植物表达元件可以与设计用于表达由本文所述的任何多核苷酸编码的一种或多种多肽(诸如与HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1具有实质同一性的多肽)的多核苷酸一起用于植物或植物组分中。本文提供植物表达盒，所述表达盒包括本文所述的多核苷酸中的一种或多种，其编码其相应多肽中的一种或多种，或编码其部分的昆虫抑制性蛋白，所述表达盒将提供植物中一种或多种多肽的表达。优选的植物可表达的多核苷酸序列可以针对在源自目标植物物种或相关植物物种的原生质体细胞中的最佳表达进行评估或根据本文所述的任何方法进行评估。在选择给出最佳表达的那些设计的多核苷酸序列之后，然后将选择的序列转化至稳定的植物中用于连续选择。包括上述植物表达盒的DNA构建体通常保持于各种载体中。载体含有提供宿主细胞中载体和共价连接的序列的复制的序列。例如，细菌载体将含有允许载体在一种或多种细菌宿主中复制的复制起点。农杆菌介导的植物转化载体通常包含允许在大肠杆菌和农杆菌两者中均复制的序列，以及定位以便允许表达盒整合至植物染色体中的一个或多个“边界”序列。编码赋予抗生素抗性的基因的可选择标记通常也包括于载体中以提供其在细菌宿主中的维持。转基因植物和用于获得昆虫抑制性转基因植物的方法本发明还提供获得能够抑制害虫的转基因植物(或转基因植物组分)的方法。首先，使用转化技术根据本领域众所周知的标准方法将适于表达本文公开的任何多肽的表达的载体引入植物、植物细胞或植物组织中。接下来，通过从接受表达载体的植物、植物细胞或植物组织再生转基因植物而获得含有植物表达载体的转基因植物。最后一步是获得表达昆虫抑制量的多肽的转基因植物。本文考虑的表达昆虫抑制量的一种或多种多肽(诸如与HtA(天然)、HtA(短)、ASAL(天然)、ASALR(天然)、ASALR(短)、ACA(天然)、ACA(短)、ACT(天然)或ACT(短)、MpNPR1或CsNPR1或其任何组合的实质同一性)的转基因植物包括但不限于茄科植物诸如番茄和马铃薯以及柑橘植物诸如橙、柠檬、酸橙和葡萄柚。植物表达载体可以经由方法诸如农杆菌介导的转化、颗粒介导的转化、DNA转染或DNA电穿孔或通过所谓的须介导的转化(whiskers-mediatedtransformation)引入宿主植物的染色体中。引入转基因的示例性方法是本领域技术人员众所周知的。例如，用于经由幼体或成体组织的农杆菌介导的转化产生转基因柑橘的方法描述于Orbović和Grosser,“Chapter17:Citrus”，AgrobacteriumProtocols,第二版，第2卷,KanWang,编辑,HumanaPress,Totowa,NewJersey(2006)。本领域技术人员将进一步理解，任何这些基因转移技术都可用于将表达载体引入植物细胞、植物组织、植物或植物组分的染色体中。在将植物表达载体引入植物细胞或植物组织之后，通常通过在促进形成完整植物(即，再生叶、茎、根和（在某些植物中）生殖组织的过程)的条件下培养这些细胞或组织而将转化的细胞或组织再生为完整植物。从单一植物原生质体或各种外植体发育或再生转基因植物是本领域众所周知的。该再生和生长过程通常包括选择转化的细胞和在将产生生根幼苗的条件下培养选择的细胞的步骤。其后将所得的转基因生根的苗种植于适当的植物生长介质诸如土壤中。已并入其基因组中编码一种或多种本文所述多肽的转基因DNA区段的转基因植物在本发明的范围内。进一步认识到，可以通过使用PCR或可以特异性检测DNA构建体中的序列的其他方法来鉴定含有本文所述的DNA构建体的转基因植物和由其衍生的材料。一旦再生或回收转基因植物，多种方法可用于鉴定或获得表达抑制量的一种或多种本文所述的多肽的转基因植物。一组通用方法是进行测量产生的多肽的量的测定法。或者，可以测定由转基因植物产生的mRNA的量，以鉴定表达昆虫抑制量的多肽的植物。也可以通过直接测定此类植物的昆虫抑制(例如，如本文所述)来鉴定表达昆虫抑制量的多肽的转基因植物。吸汁害虫防治包括编码一种或多种本文所述的多肽或其昆虫抑制片段的多核苷酸的转基因植物可用于防治昆虫侵染的方法中。示例性转基因植物包括但不限于柑橘植物诸如，例如但不限于‘Hamlin’或‘Valencia’甜橙(甜橙(CitrussinensisL.))和茄科植物诸如马铃薯(马铃薯(SolanumtuberosumL.))。由被本文所述的一种或多种多肽抑制的吸汁害虫攻击的转基因柑橘植物诸如转基因橙植物(诸如‘Hamlin’甜橙)和马铃薯或番茄在农业中是有用的。受保护免于吸汁昆虫进食或侵染的优选的转基因植物(或转基因植物组分)包括编码本文所述的一种或多种多肽或其昆虫抑制性片段的多核苷酸。此类转基因植物对于防治刺穿植物的细胞和组织和/或从其吸取流体的半翅类吸汁昆虫(诸如木虱)的物种是特别有效的。首先通过本文所述的任一种方法鉴定表达昆虫抑制量的昆虫抑制性多肽或其昆虫抑制性片段的转基因植物。可以在受控的环境条件下(即，在封闭的生长室或温室中)进行初始昆虫抑制，评价昆虫(例如，木虱)进食。转基因植物也可以在田间测试中经受昆虫侵染，并针对非转基因对照植物进行比较。如果期望，非转基因对照植物将包括用杀虫剂处理的植物和未处理的植物两者。选择展现昆虫抑制活性(诸如使植物对于木虱侵染或进食不太有吸引力)的转基因植物株系(即，衍生自不同转化事件(包括转基因插入不同基因组位置)的转基因植物)用于潜在发育以用于多种不同的遗传背景(即，遗传不同的栽培品种、品种和/或杂交种质)中。将转基因渗入不同种质中和产生主要包括转基因种子的种子批次的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以在期望的遗传背景中以纯合状态固定转基因。一旦在该背景中固定转基因，则纯合转基因植物可用于产生非杂交作物的转基因种子。或者，纯合转基因植物可用作花粉供体或受体以产生杂交作物的转基因种子。本发明考虑表达抑制特定害虫的昆虫抑制性多肽的转基因植物的具体类型。具体考虑转基因柑橘植物，诸如但不限于表达抑制亚洲柑橘木虱的昆虫抑制性多肽的‘Hamlin’或‘Valencia’橙植物。实施例以下实施例是本发明的代表。本文公开的具体细节不应被解释为限制性的。实施例1-植物表达构建体本文所述的转化构建体的示意图显示于表1和2中。所有载体都使用标准方案产生，并且包括具有插入的PZP-RSC1多克隆位点(Hajdukiewicz等人,PlantMolBiol.25:989-994,1994)的pBINplus(vanEngelen等人,TransgenicRes4:288-290,1995)作为背景，并在转化前通过测序验证。所有构建体含有部分复制的35S启动子(本文称为35S;Kay等人,Science236:1299-1302,1987)，豆科植物矮柱花豆(Stylosantheshumilis)的过氧化物酶基因启动子Shpx6b(Curtis等，MPMI10:326-338,1997)，如本文所述克隆的来自李子(欧洲李栽培种改良法国李(PrunusdomesticaL.cv.ImprovedFrench))的蔗糖合酶1(SUS1)启动子和来自甜橙(Citrussinensis)的蔗糖合酶-I启动子(CsSUS1)(Singer等人，Planta234:623-637,2011)，所述启动子与胭脂碱合酶转录终止子(nos-t)融合。然后使用pGEMTeasy试剂盒(Promega,Madison,USA)根据制造商的说明书将所有启动子nos-t融合盒插入pBINplus载体中的多克隆位点，并将其克隆入大肠杆菌的DH-5α菌株中。随后，通过PCR扩增来自汤普森多毛菌(Hirsutellathompsonii)、苹果(Malusxdomestica)、洋葱assagi(Alliumcepaassagi)(ACA)、玫瑰红葱(Al.roseum)(ASALros)和大头蒜(Al.ampeloprasum)(ASAL)的组织的cDNA制备物获得构建体的cDNA的天然和成熟(短)版本。用于扩增天然和成熟HtAcDNA序列的引物获得自Boucias等人,J.ofinvert.Pathol.72:258-261,1998，但在5'和3'末端分别被修饰以含有BamHI和SacI限制性位点以便于克隆。用于扩增MpNPR1cDNA的引物自苹果(Malusxdomestica)获得的mRNA序列(GenBank登录号EU624123.1)，但在5'和3'末端分别被修饰以含有BamHI和SacI限制性位点以便于克隆。用于天然和成熟(短)葱属植物基因的引物也被修饰以含有BamHI和SacI限制位点以便于克隆，并且从已知序列(GenBank登录号U58947(用于ASAL)和登录号L12172(用于ACA))设计。这些引物如下：使用PlatinumPCRSuperMixHighFidelity根据制造商的说明书(Invitrogen,SanDiego,CA)进行所有PCR扩增，其具有以下热概况：94℃持续2分钟，随后30个循环的94℃持续30秒、55℃持续30秒和68℃持续2分钟。除了单个基因以外，还制备两个基因融合盒。第一种是HtA、ACA(来自洋葱assagi)和ASAL(大头蒜(Al.ampeloprasum))的成熟序列之间的融合体，命名为HtA::ACAas::ASALam。第二个含有ACA的成熟序列和来自玫瑰红葱(Al.roseum)的ASAL基因，且命名为ACAros::ASALros。通过PCR用以下引物制备HtA::ACAas::ASALam融合盒：。类似地，通过PCR使用以下引物制备ACAros::ASALros融合盒：。为了生成两种融合盒，根据制造商的说明书使用PlatinumPCRSuperMixHighFidelityPCRMix试剂盒(Invitrogen,SanDiego,CA)，其具有以下热概况：94℃持续2分钟，随后30个循环的94℃持续30秒、55℃持续30秒和68℃持续2分钟。制备cDNA后，从大肠杆菌的DH-5α菌株纯化上述启动子nos-t融合pBINplus载体，并且使用限制性酶消化和连接根据标准实践将单个基因cDNA(例如HtA天然、ACA短、MpNPR1等)和成熟基因融合盒(即HtA::ACAas::ASALam和ACAros::ASALros)的各种组合插入到启动子和胭脂碱合酶终止子(nos-t)之间。连接后，使用pGEMTeasy试剂盒(Promega,Madison,USA)根据制造商的说明书将载体转化回大肠杆菌的DH-5α菌株，以等待转化入农杆菌菌株EHA105中用于植物转化。表1构建体构建体名称启动子盒内容物表达的基因的宿主来源JM202CaMV35S35S::35S::nos-tJM220CaMV35S35S::35S::HtA天然::nos-t多毛菌JM204CaMV35S35S::35S::HtA短::nos-t多毛菌JM275CaMV35S35S::35S::ACA天然::nos-t洋葱变种aggregatumJM276CaMV35S35S::35S::ACA天然::nos-t韭菜JM277CaMV35S35S::35S::ACA短::nos-t洋葱变种aggregatumJM278CaMV35S35S::35S::ACA短::nos-t韭菜JM273CaMV35S35S::35S::ASAL天然::nos-t玫瑰红葱JM272CaMV35S35S::35S::ASAL天然::nos-t大头蒜JM274CaMV35S35S::35S::ASAL短::nos-t玫瑰红葱JM282CaMV35S35S::35S::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t多毛菌，洋葱变种aggregatum，韭菜JM283CaMV35S35S::35S::ACA短::ASAL短::nos-t韭菜，玫瑰红葱JM210CaMV35S35S::35S::GUS::nos-tJM206Shpx6bShpx6b::nos-tJM221Shpx6bShpx6b::HtA短::nos-t多毛菌JM264Shpx6bShpx6b::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t多毛菌，洋葱变种aggregatum，韭菜JM285Shpx6bShpx6b::ACA短::ASAL短::nos-t韭菜，玫瑰红葱表2额外构建体构建体名称启动子盒内容物表达的基因的宿主来源EK101Sus1Sus1::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t欧洲李，多毛菌，洋葱变种aggregatum，韭菜EK102Sus1Sus1::MpNPR1::nos-t欧洲李，苹果EK103Sus1Sus1::CsNPR1::nos-t欧洲李，甜橙EK104CsSUS1CsSUS1::HtA短::ACA短::ASAL短::nos-t甜橙，多毛菌，洋葱变种aggregatum，韭菜EK105CsSUS1CsSUS1::MpNPR1::nos-t甜橙，苹果EK106CsSUS1CsSUS1::CsNPR1::nos-t甜橙实施例2通过根癌农杆菌介导的转化根据标准方法使用实施例1中描述的植物表达构建体，获得转基因番茄植物。通过将番茄木虱(B.catterelli)置于含有转基因和对照非转化叶的小室中，生物测定转基因植物对番茄木虱(B.catterelli)的吸引力。将叶上没有残留木虱的那些植物鉴定为对木虱不太有吸引力，因此不太可能被木虱的进食吻突(feedingproboscises)刺穿。典型的测定法涉及制备含有对照和转基因番茄叶的室，并将约5个木虱引入室中。在设置测定之后十八至二十四小时，通过计数转基因叶上的木虱数目相比于对照叶上的数目来监测木虱位置。当在转基因叶上发现0或1个木虱、而在对照叶上发现更多木虱时，转基因植物株系被当作有用的。在一些、但不是所有的实验中，与对照叶相比，转基因叶对木虱不太有吸引力。下表3显示被鉴定为对木虱不太有吸引力的转基因株系的选择结果。表3构建体启动子基因来源#转基因株系#无吸引力株系%无吸引力株系20435SHta短多毛菌12433221Shpx6bHta短多毛菌8450总计Hta短多毛菌2084027235SASALA长大头蒜2731127435SASALR短玫瑰红葱2031527735SACA短洋葱aggregatum86141627835SACT短韭菜4971428235SHta-ACA-ASALR多毛菌，洋葱aggregatum，和玫瑰红葱3451528335SACA-ASALR洋葱aggregatum，和玫瑰红葱35926NPR135SMpNPR1苹果22523来自多毛菌真菌的基因Hta在番茄中最有效地阻止木虱的进食。具有两个葱属植物凝集素(ACA-ASALR)基因的堆叠构建体同样有效地阻止木虱的进食。实施例3-柑橘青果病的预防柑橘青果病(黄龙病(Huanglongbing),HLB)由限于韧皮部壁的细菌(phloem-limitedwalledbacterium)柑橘黄龙病菌亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus)引起。HLB由亚洲柑橘木虱(柑橘木虱(Diaphorinacitri))携带。已经用来自定殖于昆虫的多毛菌真菌和来自葱属植物(洋葱科)物种的几种基因转化的番茄植物的生物测定证明，在转基因株系中并入这些基因抑制木虱昆虫的进食。然后在橙植物中测试使番茄植物对番茄木虱“无吸引力”的构建体，以确定此类构建体是否使橙植物对亚洲柑橘木虱无吸引力，因此可能干扰引起HLB的细菌的传播。通过根癌农杆菌介导的转化根据标准方法使用实施例1中描述的植物表达构建体，获得转基因“Hamlin”甜橙(甜橙(Citrussinensis(L.)Osbeck)植物。构建体JM204、JM277和JM282在本发明中特别有用。具体而言，已经使用JM277(ACA短)和JM282(Hta-ACA-ASALR)构建体生成转基因Hamlin植物。如实施例2中所述，通过将木虱置于含有转基因和对照非转化叶(例如幼叶)的小室中，鉴定并生物测定转基因Hamlin植物对亚洲柑橘木虱的无吸引力。如实施例2中所述，将叶上没有残留木虱的那些植物鉴定为对木虱不太有吸引力，因此不太可能被木虱的进食吻突(feedingproboscises)刺穿。此类无吸引力的转基因柑橘植物被当作可用于本发明。实施例4-马铃薯中的木虱黄斑和斑马片病的预防马铃薯中的斑马片病被认为是由B.cockerelli马铃薯/番茄木虱携带的Liberibactersolanacearum引起。木虱黄斑是一种马铃薯病，其被认为是由马铃薯/番茄木虱的幼虫阶段产生的毒素引起。已经用来自定殖于昆虫的多毛菌真菌和来自葱属植物(洋葱科)物种的几种基因转化的番茄植物的生物测定证明，这些基因的并入抑制木虱昆虫的进食。假设这些转化的番茄植物对马铃薯/番茄木虱(B.cockerelli)的“非吸引力”表明在马铃薯植物中转化相同的基因将减少木虱的进食，并因此干扰Liberibactersolanacearum(斑马片病的病因)和诱导木虱黄斑的毒素的传播。通过根癌农杆菌介导的转化根据标准方法使用实施例1中描述的植物表达构建体，获得转基因马铃薯(马铃薯(SolanumtuberosumL.))植物。预测构建体JM204、JM277和JM282在本发明中特别有用。如实施例2中所述，通过将昆虫置于含有转基因和对照非转化叶的小室中，鉴定并生物测定转基因马铃薯植物对马铃薯/番茄木虱(B.cockerelli)的无吸引力。如实施例2中所述，将叶上没有残留木虱的那些植物鉴定为对木虱不太有吸引力，因此不太可能被木虱的进食吻突(feedingproboscises)刺穿并成为细菌和毒素的受体。此类无吸引力的转基因植物被当作可用于本发明。由于可以在不背离本发明的范围的情况下对本文描述和举例说明的构建和方法进行各种修改，因此意欲前面描述中含有的所有内容应当被解释为说明性的，而不是限制性的。因此，本发明的宽度和范围不应当由任何上述示例性实施方案来限定，而应当仅根据随后所附权利要求及其等同方案来限定。序列表<110>CornellUniversity<120>用于阻止木虱进食的组合物和方法<130>50341-025WO2<150>US62/008,934<151>2014-06-06<160>41<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>495<212>DNA<213>汤普森多毛菌<400>1atgaaggcctttactgccattctcgccagcgcggccttgttcgccaccggcctcgcggct60cccgcctcagaagccacctcggtgaacagcctggaagagcgcgctcccatcgtcacctgc120cggcccaagctcgacgggcgggagaagccgttcaaggtagacgtggcgacggcgcaggca180caggcgcgcaaggcgggcctgacgacgggcaagagcggcgaccctcaccggtacttcgcc240ggcgaccacatccgctggggcgtcaacaactgcgacaaggcggacgcgatcctgtgggag300tacccgatctactgggtcggcaagaacgccgagtgggccaaggacgtcaagacgtcgcag360caaaagggagggccgacgccgatccgcgtcgtctacgccaacagcaggggcgccgtgcag420tactgcggcgtcatgacgcacagcaaggtcgacaagaataaccagggcaaggagttcttt480gagaagtgcgattag495<210>2<211>164<212>PRT<213>汤普森多毛菌<400>2MetLysAlaPheThrAlaIleLeuAlaSerAlaAlaLeuPheAlaThr151015GlyLeuAlaAlaProAlaSerGluAlaThrSerValAsnSerLeuGlu202530GluArgAlaProIleValThrCysArgProLysLeuAspGlyArgGlu354045LysProPheLysValAspValAlaThrAlaGlnAlaGlnAlaArgLys505560AlaGlyLeuThrThrGlyLysSerGlyAspProHisArgTyrPheAla65707580GlyAspHisIleArgTrpGlyValAsnAsnCysAspLysAlaAspAla859095IleLeuTrpGluTyrProIleTyrTrpValGlyLysAsnAlaGluTrp100105110AlaLysAspValLysThrSerGlnGlnLysGlyGlyProThrProIle115120125ArgValValTyrAlaAsnSerArgGlyAlaValGlnTyrCysGlyVal130135140MetThrHisSerLysValAspLysAsnAsnGlnGlyLysGluPhePhe145150155160GluLysCysAsp<210>3<211>396<212>DNA<213>汤普森多毛菌<400>3atggctcccatcgtcacctgccggcccaagctcgacgggcgggagaagccgttcaaggta60gacgtggcgacggcgcaggcacaggcgcgcaaggcgggcctgacgacgggcaagagcggc120gaccctcaccggtacttcgccggcgaccacatccgctggggcgtcaacaactgcgacaag180gcggacgcgatcctgtgggagtacccgatctactgggtcggcaagaacgccgagtgggcc240aaggacgtcaagacgtcgcagcaaaagggagggccgacgccgatccgcgtcgtctacgcc300aacagcaggggcgccgtgcagtactgcggcgtcatgacgcacagcaaggtcgacaagaat360aaccagggcaaggagttctttgagaagtgcgattag396<210>4<211>131<212>PRT<213>汤普森多毛菌<400>4MetAlaProIleValThrCysArgProLysLeuAspGlyArgGluLys151015ProPheLysValAspValAlaThrAlaGlnAlaGlnAlaArgLysAla202530GlyLeuThrThrGlyLysSerGlyAspProHisArgTyrPheAlaGly354045AspHisIleArgTrpGlyValAsnAsnCysAspLysAlaAspAlaIle505560LeuTrpGluTyrProIleTyrTrpValGlyLysAsnAlaGluTrpAla65707580LysAspValLysThrSerGlnGlnLysGlyGlyProThrProIleArg859095ValValTyrAlaAsnSerArgGlyAlaValGlnTyrCysGlyValMet100105110ThrHisSerLysValAspLysAsnAsnGlnGlyLysGluPhePheGlu115120125LysCysAsp130<210>5<211>513<212>DNA<213>大头蒜<400>5atgagcgtggccactgtagccaccatcctaaccattttggcatctacatgcatggccaga60aacgtattggtgaacaacgaaggactgtacgcaggccaatccctagtcgaggaacagtac120acttttataatgcaggatgactgcaaccttgtactgtatgaatacagcacccccatctgg180gcctcaaacacaggcatcaccggtaaaaatgggtgcagggccgtgatgcagcctgatggc240aactttgtcgtctacgatgttaaggggcgtgccgtctgggccagtaacagcagaagaggg300aacgggaactatatcctggtgcttcagaaggacagaaacgttgttatttacggatctgat360atttggtctactggcacataccggaaaaaagtgggtggaactgttgttatggctatgagt420ggtacggtcgatggaggctccgcgattggaccggtaacagtgaatcagaatgtcactgcc480gtccgaaaggttgcagcagctgctgctgcttga513<210>6<211>170<212>PRT<213>大头蒜<400>6MetSerValAlaThrValAlaThrIleLeuThrIleLeuAlaSerThr151015CysMetAlaArgAsnValLeuValAsnAsnGluGlyLeuTyrAlaGly202530GlnSerLeuValGluGluGlnTyrThrPheIleMetGlnAspAspCys354045AsnLeuValLeuT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