一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及农业和生物
技术领域：
，尤其涉及一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：微生物农药，是指应用活体微生物及其代谢产物对农业病虫害进行防治。微生物农药具有选择性强，对人、畜、农作物和自然环境安全，不易产生抗药性等特点，因此得到了广泛研究。目前市场上已经有较为成熟的微生物农药产品，例如苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。马铃薯是我国重要的农作物之一，地位仅次于水稻、小麦和玉米，为我国第四大农作物。马铃薯的种植区域广泛，病害也较为复杂，其中由多种植物病原链霉菌引起的马铃薯疮痂病是当今影响马铃薯生产的重要病害之一。马铃薯疮痂病的发生原因①种薯带菌。在种薯生产中微型薯的疮痂病尤为严重，带病种薯的运转是病害传播的重要途径之一。②土壤偏碱。东北地区栽培马铃薯常常施用草木灰等碱性肥料，多年累积后土壤逐渐偏碱，造成马铃薯疮痂病逐年加重。在西北、华北的一些地区，气候多比较干旱，加之农民使用一些碱性肥料，病害往往会偏重。③病原菌在土壤中积累。华南一些地区，由于多年的连作也会造成病菌大量积累。④重视程度不够。疮痂病对马铃薯的产量和肉质影响并不大，虽然该病已经成为马铃薯生产的一大障碍，并且会严重影响马铃薯的贮藏，但还未引起人们的足够重视，很多地区对该病还都不甚了解，也成为了马铃薯疮痂病逐年加重的原因。马铃薯疮痂病病菌主要为害块茎，从皮孔侵入，发病初期在块茎表皮产生褐色斑点，以后逐渐扩大，侵染点周围的组织坏死，块茎表面变粗糙，质地木栓化。同时依据病原菌种类的不同，在成熟的薯块上常表现为凸起或凹陷的表面病斑，严重时病斑连片，薯块的品质降低。同时，由于表皮组织被破坏后，易被其他病原菌侵染，造成块茎腐烂。目前农业上对马铃薯疮痂病的防治主要采用轮作或者使用农药喷洒，不利于马铃薯的生产和食品、生态的安全，利用生物防治土传病害是一种行之有效的防治措施，是植物保护中必不可少的组成部分。特别是利用自然界中原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物的拮抗作用，来控制病原微生物的危害，具有较小的环境风险，是一种环境友好的防治技术。技术实现要素：本发明所要解决的问题是通过一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用，实现对马铃薯疮痂病的防治，可以达到安全、高效的防治效果。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种以甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)JQ—018为活性成分的可湿性粉剂，是将甲基营养型芽孢杆菌JQ-018经种子活化、种子培养、发酵培养、干燥成甲基营养型芽孢杆菌JQ-018粉末并添加白炭黑、硅藻土、可溶性淀粉、助剂成分后制成；甲基营养型芽孢杆菌JQ-018，简称JQ—018菌株，是从河北省张北县大囫囵村马铃薯根际土壤中分离获得，已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11838。本发明的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018从河北省张北县大囫囵村马铃薯根基土壤中分离、纯化以及筛选步骤获得的，采用形态特征、生理生化实验、分子生物学鉴定法以及16SrDNA同源序列比对分析最终确定上述保藏编号的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。优选的，甲基营养型芽孢杆菌JQ-018粉末以及各添加成分的重量百分比为甲基营养型芽孢杆菌JQ-018粉末20-40％、硅藻土10-20％、助剂15-20％、可溶性淀粉20-30％、白炭黑10-15％。优选的，可湿性粉剂的助剂组成成分为：分散剂D—1002(改性烷基萘磺酸盐，北京汉莫克化学技术有限公司)、润湿剂W—2001(改性烷基硫酸盐，北京汉莫克化学技术有限公司)、亚甲基双萘磺酸和十二烷基硫酸钠，且其质量比为3:1:5:4。甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的可湿性粉剂的制备方法，具体步骤如下：(1)菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株接种于LB固体培养基上，于35-38℃培养36h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于35-38℃培养16-24h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。(2)一级种子液制备：按照5-10％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(1)制备的接种液，转速200-260rpm，温度35-38℃，摇床培养16-24h，作为一级种子液。(3)二级种子液制备：按照0.5-3％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(2)制备的一级种子液，通气量为0.4-1.5V/V〃min，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为18-24h。作为二级种子液。所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1-2％，蛋白胨1-1.5％，酵母粉0.6-1％，牛肉膏0.5-0.7％，氯化钠0.5％。其余为水。(4)发酵培养：按照5-10％(体积百分比)的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的二级种子液，通气量为0.4-1.5V/V〃min，搅拌速度为180-260rpm，培养时间为24-30h，得到JQ-018菌株发酵液。所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖3-5％，蛋白胨0.5-1.5％，酵母粉0.03-0.08％，蛋白胨0.1-0.3％，豆粕粉0.5-1.5％，硫酸镁0.01-0.05％，硫酸锰0.01-0.05％，其余为水。(5)将发酵液进行压滤，收集滤饼进行沸腾干燥，得到固体的JQ-018，将重量百分比的20-40％的固体JQ-018菌、10-20％的硅藻土、15-20％的助剂、20-30％的可溶性淀粉、10-15％的白炭黑混合均匀混合；然后利用气流粉碎机粉碎；得到甲基营养型芽孢杆菌JQ-018可湿性粉剂。优选的，上述步骤(5)中的沸腾干燥温度为80℃。优选的，上述步骤(5)中可湿性粉剂的细度在400目以上。优选的，上述步骤(5)中气流粉碎机是在30～50℃温度范围内将混合物粉碎。进一步的，还提供一种甲基营养型芽孢杆菌为活性成分的可湿性粉剂在制备防治马铃薯疮痂病药物中的应用。由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：该菌种具有适应性强，稳定性好，不易老化、对病原菌拮抗性强等特点。由此制备的菌剂能够高效拮抗马铃薯疮痂病的病原菌、刺激植物生长、改善作物品质，从而达到增产、高产的目的。同时安全高效，无残留，无毒副作用，能够减少化学农药的使用，在生物防治马铃薯疮痂病中具有重要应用前景。附图说明下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌菌株的显微形态及菌落形态；图2是本发明甲基营养型芽孢杆菌菌株的系统发育树(图中菌株3)；图中，图1:A为菌株的显微形态；B为菌株的菌落形态。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。实施例1：JQ-018菌株的获得、鉴定和保藏一、JQ-018菌株的获得1、本发明的甲基营养型芽孢杆菌(JQ-018菌株)是从河北省张北县大囫囵村马铃薯根基土壤中分离获得的。具体分离方法如下：(1)土壤采集：从土壤表层到10cm处采集土样100g，一个地点平行采集5个样本，混合过40目分级筛。取100g做分离。(2)培养基配置：分别配置NA培养基和PDA培养基，制作培养基平板。(3)准确称取1g土样置于250ml三角瓶中，加入99ml无菌水，摇床200rpm、30-37℃震荡30min。制成土壤悬浮液，按10倍梯度稀释至10-8。分别在NA培养基和PDA培养基中分离单菌落，分离到的单菌落分别在NA培养基和PDA培养基中活化4个周期。2、筛选将分离活化的单菌落与纯化培养的马铃薯病原菌进行平板对峙实验，以下是筛选过程对峙实验及其结果：在高氏一号培养基及PDA培养基平板中央接入预先培养的病原菌(马铃薯疮痂病病原菌)，待生长大小合适时用直径9mm的打孔器打出菌斑，移至新的培养基平板中央，在距离病原菌菌斑2cm处接种菌种单菌落，每个处理重复3次，置于25℃生化培养箱培养3-6天，观察各菌落直径，测定抑菌率。抑菌率(％)＝(对照组直径-处理组直径)/对照菌落直径×100％表1单菌落对疮痂病病原菌处理的处理组直径(cm)菌株名称处理1处理2处理3平均JQ-0112.22.22.12.16JQ-0121.81.81.71.77JQ-0132.42.32.22.30JQ-0142.52.62.62.57JQ-0151.71.81.71.73JQ-0161.81.51.61.63JQ-0173.13.23.33.20JQ-0181.31.21.31.27JQ-0191.41.51.61.50JQ-0202.72.82.72.73从表1可看出JQ-018菌株对马铃薯疮痂病的抑菌活性最高。继续做JQ-018菌株的拮抗实验得到如下结果，见表2。表2JQ-018发酵菌液不同菌浓度对疮痂病抑制率从表2可以看出JQ-018菌株在菌浓度范围变化较大的情况下对马铃薯疮痂病都有较好的抑制作用。二、JQ-018菌株的鉴定1、微生物学特性：JQ-018菌体呈短杆状，周生鞭毛，可产孢，革兰氏染色阳性。菌株在PDA培养基上34℃培养12h后，菌落圆形，半透明呈白色，表面光滑，中间凸起，不产生色素，有粘性。在NA培养基上菌落较小或者不生长。液体培养形成菌膜，24h后产孢，棕黄色，浑浊，有沉淀。菌株表现好氧生长。(见图1)2、生理生化实验：表3甲基营养型芽孢杆菌JQ-018的生理生化特征检测项目特性检测项目特性检测项目特性D-果糖+水杨苷-甘露醇+麦芽糖+吐温40-L-苹果酸+D-半乳糖+果糖-6-磷酸-丙酮酸+D-葡萄糖+鼠李糖-天冬酰胺+注：“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应3、分子生物学鉴定：JQ-018菌株测序后得到1414bp长的碱基序列，将该序列在NCBI数据库中比对，与Bacillusmethylotrophicus同源性达到99.38％，结合JQ-018菌株的形态特征、生理生化特性，确定所检测的JQ-018菌株属于甲基营养型芽孢杆菌，以16SrDNA序列为基础的JQ-018菌株的系统发育树如图2所示(图中菌株3即为JQ-018菌株)。三、JQ-018菌株的保藏经过鉴定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。甲基营养型芽孢杆菌JQ-018，简称JQ-018菌株，已于2015年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11838。实施例2：JQ-018菌株发酵液拮抗效果测定固体培养基：NA培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏3.0g/L、氯化钠5g/L、琼脂18g/LpH＝7.0-7.2。高氏一号培养基:可溶性淀粉20g、KNO31g、NaCl0.5g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g琼脂粉16g、蒸馏水1000ml、pH7.4，配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，融化后，补足水分至1000ml，然后用100ml锥形瓶平均分装13瓶，121℃灭菌30min。PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和16g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分瓶装，每瓶约75ml，121℃灭菌30分钟左右后取出冷却后贮存备用。液体培养基(发酵培养基)：葡萄糖20g、玉米浆干粉5g、蛋白胨1g、酵母粉0.5g、MnSO420ml、MgSO410ml、自来水500ml、pH7.5±0.1，121℃灭菌30min。一、实验方法：采用平板对峙培养法1、病原菌分离纯化培养马铃薯疮痂病病原菌取自河北省张北县大囫囵村大田内发病马铃薯块茎。用刀片取发病马铃薯块茎的病健交界处，先用升汞及酒精进行杀菌消毒处理后，接入培养基中，每个培养皿内接入4块，在25℃恒温培养箱中培养6天后用打孔器取病菌块进行纯化培养，备用。2、JQ-018菌株发酵液的制备将保存在斜面上的菌种用接种环接入营养琼脂平板上划线培养，37℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有50ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在34℃、230r/min条件下，摇床振荡培养25h，制备菌种发酵液，待其完全产孢后，测定发酵液菌量。3、发酵液处理将测定好活菌数的发酵液稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2亿/毫升菌浓度，与45℃熔融态的高氏一号培养基混匀，制成带菌平板，平均每板含有1ml菌液；以不接种JQ-018菌株的发酵液与培养基混匀倒成的平板为对照。在平板中接入预先培养的马铃薯疮痂病病菌，用直径5mm的打孔器打出菌块，接入凝固的培养皿内，每平板均匀接种两片，每处理重复3次。25℃恒温箱中倒扣培养6天。4、试验数据处理待对照菌丝长满板时，拍照记录，观察菌体长势情况并采用十字交叉法测量菌落直径，抑菌圈直径，计算平均值和相对抑菌率记录菌落直径大小，比较不同菌量对病原菌的抑制效果，按照下列公式计算抑菌率。抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％5、结果展示如表4表4.甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株发酵液拮抗效果结果显示：菌浓度为1.0亿/毫升时平均抑菌率最高，可达到82.17％。实施例3:甲基营养型芽孢杆菌JQ-018可湿性粉剂的制备和应用一、菌剂的制备：(1)菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株接种于LB固体培养基上，于36℃培养36h；挑取单菌落转接到LB斜面培养基上，于36℃培养20h，用无菌水洗下培养基表面菌体作为接种液。(2)一级种子液制备：按照10％(体积百分比)的接种量向LB种子培养基中接入步骤(1)制备的接种液，转速220rpm，温度36℃，摇床培养20h，作为一级种子液。(3)二级种子液制备：按照3％(体积百分比)的接种量向种子培养基中接入步骤(2)制备的一级种子液，通气量为1.0V/V〃min，搅拌速度为220rpm，培养时间为20h。作为二级种子液。所述种子培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖2％，蛋白胨1.5％，酵母粉0.8％，牛肉膏0.6％，氯化钠0.5％。其余为水。(4)发酵培养：按照10％(体积百分比)的接种量向发酵培养基中接入步骤(3)制备的二级种子液，通气量为1.0V/V〃min，搅拌速度为220rpm，培养时间为28h，得到JQ-018菌株发酵液。所述发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖5％，蛋白胨1.5％，酵母粉0.06％，蛋白胨0.2％，豆粕粉1.0％，硫酸镁0.03％，硫酸锰0.03％，其余为水。(5)将发酵液进行压滤，收集滤饼进行沸腾干燥，干燥的温度为80℃，干燥后得到固体的JQ-018干粉；按照干粉中的活菌数进行配制：a)将重量百分比的20％的固体JQ-018干粉、20％的硅藻土、20％的助剂、25％的可溶性淀粉、15％的白炭黑混合均匀混合；b)将重量百分比的40％的固体JQ-018菌、10％的硅藻土、15％的助剂、25％的可溶性淀粉、10％的白炭黑混合均匀混合；c)将重量百分比的30％的固体JQ-018菌、15％的硅藻土、18％的助剂、25％的可溶性淀粉、12％的白炭黑混合均匀混合。然后利用气流粉碎机在30～50℃温度范围内将混合物粉碎至400目以上，控制水分含量≤5％。得到甲基营养型芽孢杆菌JQ-018可湿性粉剂。二、JQ-018菌剂大田试验的应用1、供试药剂本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌JQ-018菌株可湿性粉剂2、供试作物与防治对象供试作物为马铃薯，防治对象：马铃薯疮痂病3、试验地情况试验地设在河北省张北县大囫囵村，海拔1600-1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15％-1.35％。4、马铃薯疮痂病大田试验①试验设计及安排本试验设计了菌含量超过2亿/克甲基营养型芽孢杆菌(JQ-018菌株)可湿性粉剂50克/亩(处理组一)、100克/亩(处理组二)、150克/亩(处理组三)及空白对照(清水处理)共4个处理，重复4次，共16个小区，每小区面积10m2，各小区随机排列。播种马铃薯前混水浇灌冲施第一次，现蕾开花期浇灌冲施第二次，结薯期浇灌冲施第三次。②试验调查及计算方法于马铃薯收获期，调查每组发病率并统计产量。每组分别统计总薯块数和发病薯块数量，计算发病率，生防率和产量。发病率＝发病薯块数量/总薯块数量×100％生防率＝(对照组发病率-试验组发病率)/对照组发病率×100％。③结果表5.马铃薯疮痂病发病情况处理组总薯块数发病块数发病率对照组1729756.40％处理组一1683118.45％处理组二1591911.95％处理组三157117.01％表6.使用可湿性粉剂的病害指数和防治效果处理组平均病害指数(％)平均防治效果(％)清水对照56.40-可湿性粉剂50克/亩18.4567.28可湿性粉剂100克/亩11.9578.81可湿性粉剂150克/亩7.0187.57结果显示，甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯疮痂病有较好的防治效果，其中甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂菌含量为150克/亩防治效果最好，防治效果达到了87.57％。④小结从马铃薯发病率及生防率来看，菌含量超过2亿/克甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂对马铃薯疮痂病有较好的防治效果，每亩施用150克效果最佳，防治效果可以达到87.57％，发病率明显小于对照处理。发酵菌液及干粉稀释后喷洒效果虽然优于可湿性粉剂，但因为在实际应用中存在生产运输成本高，产品保存期短等缺点，所以在此没有提供相应的实验数据来论证。当前第1页1 2 3