技术领域本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种泡囊草的组织培养方法。
背景技术：
泡囊草系茄科植物泡囊草(PhysochlainaPhysaloides(L.)G.Don)的干燥根，作为蒙药“混-浩日素”始载于藏、蒙医药经典著作《无误蒙药鉴》中,《认药白晶鉴》等文献均有记载，为中华人民共和国卫生部药品标准(蒙药分册)收载的品种[云彩麟,宋宏春,张宏宇,刘东明.泡囊草不同炮制方法对急性毒性和药效的影响[J].中国民族医药杂志.2008.3:57～58]。已有泡囊草中莨菪碱含量测定的相关文献[张润祥.HPLC法测定蒙药材泡囊草(混-好日苏)中莨菪碱的含量中国药品标准[J].2011.12(6):419～421]，其主要成分为山莨菪碱、莨菪碱、东莨菪碱、新芦丁及红古豆碱等[ReinoutsvanHaga,R:cuscohygrine,anormalconstituentalkaloidofAtropabelladonna[J].Nature.1954.174:833]，蒙医药理论研究表明“混-浩日素”具有杀“黏”、消肿、杀虫、镇痛、解痉、壮阳等功效，用于“黏”性胃炎、结喉、发症、虫疾、脑刺痛、头痛,阳痿等的治疗[国家中医药管理局.中华本草蒙药卷[M].上海科技出版社.2004.233]。泡囊草主产于内蒙古自治区锡林郭勒阿巴嘎旗、呼伦贝尔鄂温克旗和乌兰察布市，我国的新疆、黑龙江、河北等省区也有分布，生于山坡、山沟及草地。由于资源少、分布地区局限，因此进行组织培养试验，为蒙药的现代化发展，大面积栽培生产和开发利用泡囊草及同属其它种植物资源提供依据和参考。组织培养中可用做外植体进行培养的材料很多，例如带腋芽茎段、根、茎尖等，花丝、花梗、花托、花柱、子房等花器官也可用于外植体培养[张彦妮.影响植物组织培养成功的因素[J].北方园艺,2003(3):132～133；姚连芳,周俊国等.百合的组织培养试验研究[J].贵州农业科学.1999.27(3):47～48；唐东芹等.百合基因转化胚性愈伤组织受体系统的建立[J].浙江林学院学报.200320(3):273～276；白美发.青山百合的组织培养与快速繁殖[J].贵州农业科学.2003.31(6):25～26；李睿.麝香百合的组织培养与快速繁殖[J].甘肃林业科技.2003.28(2):13～14],在实际生产中需要根据芽的增殖途径和试验目的来选择合适的外植体。不同的植物组织对营养成分的要求不同，禾谷类的花药培养，可以选择高磷的N6培养基，而草莓的花药培养以低盐的White培养基比较适宜，马鞭草科乔木和柚木必须在高盐的MS培养基中才能成苗，杜鹃花的茎尖培养常用1/4MS或采用6,7-V培养基[涂艺声.经济植物大规模快速繁殖技术[M].化学工业出版社.2009.35]。目前还没有对泡囊草进行组织培养获得成功的报道，在实际生产中需要筛选适宜的泡囊草培养基。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种泡囊草的组织培养方法，该方法用于泡囊草的组织培养，具有繁殖速度快、诱导率高和移栽成活率高的优点。基于上述目的，本发明提供的一种泡囊草的组织培养方法，包括以下步骤：(1)外植体灭菌选取泡囊草当年生、健壮枝条上的叶片为外植体，用解剖刀将外植体切成5×5mm的茎段，用中性洗涤剂洗涤外植体茎段10min洗掉表面污渍后，自来水下冲洗20min，滤纸吸干水分后置于超净工作台灭菌，用质量分数为0.1％升汞进行消毒处理2～3min，无菌水冲洗3～5次；(2)泡囊草芽的初代诱导培养将灭菌好的外植体茎段接种到初代诱导培养基上，初代诱导培养7～15天，至新芽长出；(3)继代增殖培养将获得的新芽接种到继代增殖培养基上，继代增殖培养20～26天，至不定芽伸长至2～3cm；(4)组培苗生根将不定芽自基部切下，接种到生根培养基上，培养18～21天，至幼根伸长至2～3cm；(5)组培苗移栽将幼根伸长至2～3cm的组培苗在室温下炼苗2～3天后，除去培养瓶的封口膜，在培养瓶内添加8mL水续炼苗3～5天，然后取出组培苗，洗去根上附着的多余培养基，用稀释10倍的多菌灵溶液浸泡8～10min，移栽到含水量为68％～71％的无菌营养土中，外覆塑料薄膜保湿，14～15天后移栽到大田，即可。优选的，步骤(2)中所述初代诱导培养的条件为：培养室温度为20～28℃，光照12-14h，光照强度2000-2500Lx。优选的，步骤(2)中所述初代诱导培养基为MS基本培养基；所述初代诱导培养的时间为7～10天。优选的，步骤(3)中所述继代增殖培养的条件为：培养室温度为20～28℃，光照12-14h，光照强度2000-2500Lx。优选的，步骤(3)中所述继代增殖培养基为MS基本培养基；所述继代增殖培养的时间为21～23天。优选的，步骤(4)中所述组培苗生根的条件为：培养室温度为20～28℃，光照12-14h，光照强度2000-2500Lx。优选的，步骤(4)中所述生根培养基是在MS基本培养基中添加0～0.5mg/LIBA得到的。优选的，所述生根培养基是在MS基本培养基中添加0.02～0.03mg/LIBA得到的。优选的，步骤(5)中所述无菌营养土包含腐殖质和珍珠岩，其中腐殖质和珍珠岩的质量比为1～2。从上面所述可以看出，本发明提供的泡囊草的组织培养方法，该组织培养方法选用泡囊草叶片为合适且易获得的外植体，其分化能力强，对培养基要求不严、污染率低，增殖速度快；外植体材料用质量分数为0.1％升汞进行消毒处理2～3min，诱导率可达100％且无污染；选择广泛使用的MS基本培养基，其在外植体培养及继代增殖培养中不需要添加任何激素，即可取得理想的增殖效果，可有效降低成本；而且当泡囊草的幼根长到2～3cm时，移栽成活率可达96.7％。附图说明图1为泡囊草的组织培养图；其中A图为继代增殖培养22天时，不定芽分化情况图；B图为不定芽在含有0.025mg/LIBA的生根培养基中培养18～21天的生根情况图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。实施例1泡囊草的组织培养方法，该方法包括以下步骤：1.1外植体的建立供试材料为内蒙古农牧业科学院草业中心采于内蒙古自治区锡林郭勒盟阿巴嘎旗的泡囊草植株，种植于苗钵内，选择当年生、健壮枝条上的叶片作为外植体。1.2试验方法1.2.1外植体灭菌选择当年生、健壮枝条上的叶片为外植体，用解剖刀切成5×5mm的茎段，用中性洗涤剂洗涤外植体茎段10min洗掉表面污渍后，自来水下冲洗20min，滤纸吸干水分后置于超净工作台灭菌，用质量分数为0.1％升汞进行消毒处理，处理时间见表1，无菌水冲洗3～5次，然后接种于MS培养基中，20天后观察统计，比较不同灭菌消毒时间的培养效果。表1消毒处理方式1.2.2MS基本培养基制备本发明所使用的MS基本培养基制备方法如下：MS培养基粉末购自青岛高科园海博生物技术有限公司，将购买的MS培养基粉末4.74g溶于1000mL无菌水后，加入20g/L蔗糖，7g/L琼脂，调节pH值为5.8，在121℃高压灭菌30min，备用。1.2.3培养条件培养室温度为25±1℃，光照12-14h，光照强度2000-2500Lx。1.2.4泡囊草芽的初代诱导培养本发明以MS为基本培养基，不添加任何激素，将灭菌好的外植体茎段接种于MS基本培养基后，按照1.2.3的培养条件初代诱导培养7～15天，至新芽长出；培养过程中及时观察统计，记录培养基上芽分化的情况。1.2.5继代增殖培养以MS为基本培养基，将初代培养获得的无菌芽接种到MS基本培养基上，按照1.2.3的培养条件继代增殖培养，培养20～26天后，观察并统计不定芽增殖情况。1.2.6组培苗生根不定芽长至2～3cm时自基部切下，接种于生根培养基上诱导不定根的产生，生根培养基是在MS基本培养基中添加植物生长调节剂制备得到的，植物生长调节剂选择IBA(0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg/L)7个浓度梯度，生根培养基中蔗糖浓度为20g/L，琼脂浓度为7g/L，pH值为5.8，在121℃高压灭菌30min，备用。每个处理接种10段茎段，重复3次，按照1.2.3的培养条件培养18～21天后统计生根率，筛选出最佳生根培养基。1.2.7组培苗移栽当泡囊草的幼根长到2～3cm时，将培养瓶移出光照培养箱，在室温下炼苗2～3天后，除去培养瓶的封口膜，在培养瓶内添加8mL水继续炼苗4～5天，然后取出组培苗，小心洗去根上附着的多余培养基，浸泡于稀释10倍的多菌灵溶液中8～10min，转入含水量为68％～71％的无菌营养土(腐殖质/珍珠岩(m/m)＝1～2)中，外覆塑料薄膜保湿，14～15天后移栽到大田，30天后统计移栽成活率。2结果与讨论2.1不同灭菌时间对泡囊草外植体的影响植物组织培养中最基础、最重要的环节是无菌外植体的培养，大量成功培养无菌外植体可有效加快试验进程。本发明研究了不同灭菌时间对泡囊草离体培养效果的影响，结果见表2，由表2可以看出，用质量分数为0.1％升汞进行消毒处理2～3min效果最佳，7～10天即可出芽，且无污染。随着处理时间的延长，芽诱导率下降，出芽时间延长，芽诱导率与出芽时间呈现反相关关系。表2不同消毒处理方式对泡囊草外植体的影响在实际生产中需要根据芽的增殖途径和试验目的来选择合适的外植体，就泡囊草而言，其春季返青早，四月中下旬即可开花，叶片为合适且易获得的外植体，其分化能力强，对培养基要求不严、污染率低，增殖速度快。外植体材料的消毒是影响后面的组织培养进程的重要环节，而消毒时间过长，材料受毒害作用较大，接种后影响诱导率，易造成畸形苗；消毒时间过短，消毒不彻底，易造成污染；筛选合适的消毒时间，有利于消毒后材料的恢复，提高接种后外植体的芽诱导率。泡囊草用质量分数为0.1％升汞进行消毒处理2～3min效果最佳，诱导率可达100％且无污染。2.2继代增殖培养继代培养用于材料的增殖快繁和保存，是植物组织培养快速繁殖的关键过程。根据泡囊草外植体培养实验结果，在不添加任何激素的情况下，外植体在MS基本培养基上即可快速分化增殖，因此，在不增加成本的前提下，继代培养仍选用MS基本培养基，诱导率可达100％，培养时间22天最佳，见图1A，不定芽长势较好。超过22天，部分材料出现污染现象，污染率达6.67％，叶色变黄，长势变差。对于药用经济植物的组织培养来说，可以考虑选择MS基本培养基，泡囊草作为蒙药植物，选择广泛使用的MS基本培养基可有效降低成本，其在外植体培养及继代增殖培养中不需要添加任何激素，即可取得理想的增殖效果。2.3组培苗的生根组培苗移栽前的关键步骤是生根，生根时间的快慢和根势的好坏，决定移栽的进度及成活率。本发明中不同激素浓度对泡囊草生根的影响见表3。IBA浓度以0.025mg/L为最佳生根培养基，表现为生根数量多，生长健壮，生根率可达100％，见图1B。随着IBA浓度升高，生根数量逐渐减少，当IBA浓度达到0.5mg/L时，组培苗无生根现象，且植株叶片发白，且小芽生长较慢。表3不同培养基对泡囊草根诱导的影响2.4炼苗与移栽组培苗根长势的好坏和功能健全与否，决定了移栽成活率。据试验统计，当泡囊草的幼根长到2～3cm时，移栽成活率最高，可达96.7％，过长的根须移栽时容易粘连、断裂，影响根系对营养的吸收，降低移栽成活率，根长短于1cm时，须根数量少，根系功能不健全，影响营养吸收，不利于成活。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。