一种半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法与流程

本发明涉及一种植物组织培养技术领域，尤其涉及一种半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法。

背景技术：

半枫荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)为金缕梅科半枫荷属植物,为1962年发表的新属半枫荷属的模式种,我国特有种。该种在学术研究、中医药用以及园林应用等很多方面都具有极高的价值。但由于不合理的开发利用,其资源破坏严重。半枫荷在1987年国家环境保护局等颁布的《中国珍稀濒危保护植物名录(第一册)》中,被列为国家三级重点级保护植物^[2]；在1992年傅立国主编的的《中国植物红皮书-稀有濒危植物》中被列为稀有种^[3]；在国务院1999年8月4日颁布的《国家重点保护野生植物名录(第一批)》中提升为国家Ⅱ级保护植物。2003年在汪松、解焱主编的《中国物种红色名录》中,专家根据相关资料,推测半枫荷在过去3个世代内致危因素没有停止,种群至少减少30％,因此将半枫荷列入易危等级,在未来一段时间内其种群面临绝灭的几率较高^[5]。

半枫荷药用价值：半枫荷是一种珍贵的药用植物，根、枝、树皮都可入药，能活血通络，祛风除湿，可以治疗风湿性关节炎，腰肌劳损，半身不遂，跌打瘀积、肿痛、产后风瘫，外伤常用于止血，是产区群众常用的中药。目前，半枫荷作为重要的中药已得到了广泛的重视和开发。如半枫荷散、中药巴布剂、半枫荷类注射液、苗岭骨力胶囊等。

药用半枫荷种类鉴别：在我国不同地方，叫“半枫荷”并作药用的植物共有6科8属15种，如五加科的枫荷桂(Dendvopanax dentigerus)，梧桐科的翻白叶树(Pterospermum heterophyllum)，以及樟科的檫树(Sassafras tzumu)，效用和金缕梅科的半枫荷相同，都是用根、茎或树皮入药，但金缕梅科的半枫荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)功效最佳^[9-10]。

2.半枫荷现有组织培养技术情况

在半枫荷组织培养方面，陈世红等^[11]采用单因子比较和均匀设计法，分别研究了影响半枫荷愈伤组织诱导和生长的各种因素。试验结果表明：叶片愈伤组织诱导率高于茎段；愈伤组织诱导的最适基本培养基为MS，生长的最适培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NNA1.0mg/L+蔗糖3％，暗培养对愈伤组织生长极为有利，在生根培养基上诱导生根，但多次试验均未见不定根发生。

李国桢等^[12]采用均匀设计和单因子比较法，考察不同基本培养基，光照条件，蔗糖浓度，以及不同激素种类、浓度和组合对半枫荷愈伤组织诱导、继代培养和再分化的影响。实验结果表明：叶片愈伤组织诱导率高于茎段。愈伤组织诱导的最适基本培养基为MS，生长的最适培养基为：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖3％。黑暗培养对愈伤组织生长极为有利。但生根培养基上诱导生根，但经多次试验均未见不定根发生。

胡刚等濒危植物半枫荷Semiliquidambar cathayensis组织培养快繁技术研究，以当年生半枫荷带腋芽的茎段和幼叶作为外植体，开展组织培养。研究结果表明：半枫荷叶片在初代培养基：MS+BA2.0mg/L+NNA0.5mg/L上，愈伤组织诱导率为92％，芽诱导率为16.7％，腋芽在初代培养基：MS+BA1.0mg/L+NNA0.1mg/L上，腋芽诱导率为58％，茎段能直接诱导出芽是半枫荷快繁的主要外植体。新生芽在继代增殖培养基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，芽增殖系数为3.93，增殖培养基：MS+BA(1～0.5mg)/L+NAA(0.01～0.05mg)/L，较好丛生芽生根培养基以1/2WPM+NAA2mg/L+活性碳0.2％为宜。生根率可达到90％以上。松林腐殖土+珍珠岩(4：1)比较适合半枫荷的生长移栽成活率100％，苗木长势好，叶绿色，可提供半枫荷优质种苗。

3.现有组织培养技术的不足

半枫荷对生态环境的要求比较苛刻，其自然繁殖率较低，加上人们长期的过量采挖，野生资源已经极度枯竭。面对这样严峻的形式，可见对半枫荷的人工繁殖问题的研究是极其的重要。植物组织无菌培养方法是寻求解决半枫荷资源枯竭、保护其优良品种的有效途径。近年来，人们对半枫荷的药用成分及价值的研究日益增多，目前对半枫荷从种子萌发，到增殖壮苗生根的完整流程的无菌组织培养研究还未见报道，组培无菌培养快速繁殖方面多以茎段和叶片为外植体诱导。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速的、增值率高、成活率高的半枫荷的完整的组织培养方法。

本发明的技术方案为：一种半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法，包括以下步骤：

步骤1、无菌材料的建立：取半枫荷蒴果晾晒后取种子进行无菌处理；

步骤2、种子萌发培养：将步骤1处理后的种子消毒后接种于培养基中培养，得到萌发的种子；

步骤3、诱导愈伤组织：将步骤2处理后的萌发的种子的下胚轴作为诱导材料，剪切成茎段后，接种于培养基中，培养得到愈伤组织；

步骤4、愈伤组织增殖：将步骤3得到的愈伤组织转接到培养基中，进行增殖培养；

步骤5、愈伤组织分化，将步骤4增殖后的愈伤组织切成块状物转入培养基培养，得到具有真叶的组织；

步骤6、丛生芽诱导，将步骤5中的真叶剪下后接种到培养基中，得到分化的丛生芽；

步骤7、将步骤6得到的分化的丛生芽剪去基部后，接种于培养基中，得到壮苗；

步骤8：将步骤7得到的壮苗剪去基部后，接种于培养基中，进行生根培养。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤2中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、GA₃0.2～0.8mg/L、VB₂1.0～5.0mg/L、白糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤2的培养温度为25～27℃，光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤3中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、6-BA0.5mg/L、2,4-D0.2～0.5mg/L、VB₂1.0～6.0mg/L、白糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤3的培养温度为25～27℃，光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤4中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、6-BA0.3～0.5mg/L、NAA0.05～0.4mg/L、VB₂1.0～3.0mg/L、白糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤4的培养温度为25～27℃，光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤5中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、6-BA0.03～0.08mg/L、NAA0.05～0.3mg/L、土白糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤5的培养温度为24～28℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为10小时/天。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤6中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、6-BA0.5～0.8mg/L、NAA0.1～0.3mg/L、VB₂ 1.0～5.0mg/L、白糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤6的光照强度为1500～2000lx，每天光照培养12小时。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤7中的培养基包括以下组分：改良MS培养基、NAA1.0～2.0mg/L、6-BA0.1～1.0mg/L、VB₂2.0mg/L、GA₃1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤7的光照强度为2000～3000lx，每天光照培养12小时。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的步骤8中的培养基包括以下组分：1/2改良MS培养基、NAA1.0mg/L、IBA1.0mg/L、GA₃2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂3.6g/L；

所述的步骤8的光照强度为2000～3000lx，光照培养12小时。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的改良MS培养基中NH₄NO₃含量为340mg/L、KNO₃含量为1318mg/L。

在上述的半枫荷种子萌发途径的组培快繁方法中，所述的1/2改良MS培养基中包含：

NH₄NO₃ 170mg/L；

KNO₃ 659mg/L；

MgSO₄·7H₂O 185mg/L；

KH₂PO₄ 85mg/L；

CaCl₂·2H₂O 220mg/L；

MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L；

ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L；

H3BO3 6.2mg/L；

KI 0.83mg/L；

Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L；

CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L；

CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L；

FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L；

Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

甘氨酸2.0mg/L；

盐酸硫胺素0.1mg/L；

盐酸吡哆醇0.5mg/L；

IV B烟酸0.5mg/L；

肌醇100mg/L。

本发明的有益效果如下：

本发明在以种子为外植体，对半枫荷进行研究的基础上，通过对种子苗的大量增殖形成的丛生芽，使丛生芽在不同因素影响下进行壮苗生根，以期增强试管苗生命活力，以缩短适应外界环境时间从而提高成活率。

本发明的完整的技术路线为：以种子为外植体诱导愈伤组织愈伤组织增殖、丛生芽诱导、最后通过壮苗与生根培养而建立起半枫荷完整的快繁体系。

本发明的诱导率是用种子萌发为种苗的，诱导率达到93％。诱导种苗形成直径大小在0.8～1.6cm的浅绿色愈伤组织，经愈伤组织增殖培养基使其增殖系数达到10.8。诱导丛生芽并使其增值系数达到7.9。苗高3.0～4.0cm，壮苗率100％(壮苗率(％)＝(壮苗株数/接种株数)x100％)^[14]。生根率为94.6％。利用此方法可以快速地培育出大量的半枫荷组培苗，从而有效地保护和繁殖该物种，满足市场对半枫荷的需求。

附图说明

图1和2为实施例1的种子萌发培养结果；

图3和4为实施例1的愈伤组织诱导与增值结果；

图5和6为实施例1的愈伤组织分化结果；

图7和8为实施例1的丛生芽诱导结果；

图9、10和11为实施例1的壮苗培养结果；

图12、13、14和15为实施例1的生根培养结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

一种半枫荷种子萌发途径的组织培养

(1)半枫荷种子的萌发培养：将取于广西防城港那勤的成熟的野生半枫荷蒴果，将成熟的半枫荷蒴果，晾晒到九成干后取出种子，作为外植体原材料；将选取好的种子用洗洁精清洗，置于超净工作台上，再用0.1％的次氯酸钠原液浸泡5～7min，然后用无菌水冲洗5～8次；将外植体消毒后接种于无菌诱导培养基中，在温度为25～27℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天的条件下培养，15天种子萌发率达到77％，30天后萌发率达到93％。见附图1和图2。

种子萌发培养基为：

B1：改良MS+GA₃0.2mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B2：改良MS+GA₃0.5mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B3：改良MS+GA₃0.8mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B4：改良MS+GA₃0.8mg/L+VB₂3.5mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

(2)半枫荷愈伤组织的诱导与增值：选取半枫荷种子萌发后的下胚轴作为诱导材料，剪切成1.5～2.0cm的茎段后，接种于无菌诱导培养基中在温度为25～27℃、光照强度为1500～2000lx、光照时间为10小时/天的条件下培养20～30天，形成直径大小在0.8～1.6cm的浅绿色的愈伤组织；将生长良好的愈伤组织转接入增殖培养基中，进行增殖培养培养的环境条件为：温度25～27℃、光照1500～2000lx、光照时间10小时/天。45天增殖系数达到10.8，愈伤组织颜色深绿。见附图3和4。

诱导愈伤组织培养成分：

B5：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B6：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂6.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B7：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B8：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB₂6.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B9：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

诱导愈伤组织增值培养基成分：

B10：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B11：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B12：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B13：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

(3)半枫荷愈伤组织的分化。将愈伤组织切成1.0cm²大小的块状物转入分化培养基中，在温度为24～28℃、光照强度为2000～3000lx、光照时间为10小时/天的条件下，培养45～60天，愈伤组织先是长出根部，在根长到2.0cm左右开始长出芽部分，45天后芽高约1.5cm，真叶2-4片；见附图5和6。

B14：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B15：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂3.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B16：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂4.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B17：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂5.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

(4)半枫荷丛生芽诱导。种子萌发30天后，一般已长出2～4片真叶，即可将其带节的茎剪下接到诱导丛生芽增殖的培养基中，并置于光照强度为1500～2000lx下培养，每天光照培养12小时；培养30-40天后植株高约3.0～5.0cm，增殖系数为2.8。见附图7和图8。

丛生芽诱导培养基成分：

B18：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B19：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂ 25mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B20：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.1mg/L+VB₂ 1.0mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B21：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.3mg/L+VB₂3.5mg/L+白糖30g/L+琼脂3.6g/L；

(5)半枫荷壮苗培养：将经分化的丛生芽剪去基部，接种于下面壮苗培养基中：并置于光照强度为2000～3000lx下培养，每天光照培养12小时；培养30-40天后植株高约3.0～4.0cm，根数4～6条，根长2～3cm。见附图9、图10、图11。

壮苗培养基：

B22：改良MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B23：改良MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B24：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.6g/L；

B25：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+VB₂2.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂3.6g/L；

(6)半枫荷生根培养：将经壮苗后的植株剪去基部接种于生根培养基中：并置于光照强度为2000～3000lx下培养，每天光照培养12小时；培养30～40天后植株高约3.0～4.0cm，80％出根，根数4～6条，根长2～3cm。见附图12、图13、图14、图15。

生根培养基成分：

B26：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L；

B27：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L；

B28：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA₃2.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L；

B29：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA₃2.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂4g/L；

表1、表2和表3示出了改良MS、1/2改良MS、MS的组分。

表1改良MS

表2 1/2改良MS

表3MS

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。