1.一种同时去除植物组织培养时外植体表面和内生菌的方法,其包括以下步骤:
(1)扦插土壤的消毒处理:采用50%的多菌灵对扦插土壤进行消毒处理;
(2)扦插枝条的消毒处理:采用含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对扦插枝条进行消毒处理,处理后,对扦插枝条进行顶端封腊处理;
(3)外植体的选择和消毒预处理:采用含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液对半木质化的新发枝条进行预处理;
(4)外植体的溶脂混合液预处理:采用溶脂混合液对外植体进行预处理5-6分钟;
(5)外植体的表面灭菌:
①外植体的酒精灭菌处理;
②外植体的次氯酸钠灭菌处理;
③无菌水冲洗;
(6)外植体的接种;
(7)外植体的培养;
其中所述溶脂混合液为0.1%的吐温20和10%的乙酸乙酯的水溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其中扦插土壤的消毒处理为用50%的多菌灵,以30-40g/m3的用量与扦插土壤拌匀,装入塑料袋,密闭,5天后打开,阳光下晾晒2-3天。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中扦插枝条的消毒处理为将冬眠的穗条清洗后,剪成15cm长度,浸入含有200mg/L两性霉素B和100mg/L硫酸链霉素的无菌水溶液中,处理24小时后,进行顶端封腊处理,处理后扦插到营养钵中,移入温室内进行培养。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中外植体的选择和消毒预处理为剪取半木质化的新发枝条,插入含有100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素无菌水溶液中,处理12小时后,剪去叶片,采用1%的洗洁精溶液清洗,流水冲洗后,沥干水分,放入超净工作台。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中外植体的酒精灭菌处理为采用75%的酒精灭菌30秒。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中外植体的次氯酸钠灭菌为采用10%的次氯酸钠水溶液消毒8-10分钟。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中在对外植体进行接种之前,还包括在无菌条件下将外植体材料上与消毒剂接触过的界面进行切除的步骤。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述外植体的接种是将消毒灭菌后的外植体接种在添加100mg/L两性霉素B和50mg/L硫酸链霉素的MS启动培养基中。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述外植体培养的环境条件为光周期16h/8h、光照强度2500Lux、温度27℃/21℃。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中外植体为杨树的外植体,优选为欧美杨的外植体。