短小芽孢杆菌在防治灵芝深绿木霉病害中的用途的制作方法

本发明公开了一种短小芽孢杆菌在防治灵芝深绿木霉病害中的用途，也可以其它菌类作物感染深绿木霉病害的防治，应用于属于农作物病虫害防治技术领域。

背景技术：

近些年，菌类作物感染深绿木霉病害较为普遍，特别是在东北地区，灵芝在栽培过程中由于木霉引起的病害导致减产现象十分严重，对整个产业的发展带来巨大影响。通过采用常规的化学药剂和市场购买的生防菌剂对该病原木霉进行室内试验和田间试验效果不佳。因此，提供一种能够有效地防治菌类作物感染深绿木霉病害，特别是防治灵芝深绿木霉病害是本发明要实现的主要任务。

技术实现要素：

本发明公开一种短小芽孢杆菌在防治灵芝深绿木霉病害中的用途，对于灵芝深绿木霉病具有明显的抑制作用，解决了常规的化学药剂和生防菌剂防治效果差的问题。

本发明所述的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）；

本发明所述的深绿木霉（Trichderma atroviride），属子囊菌门，粪壳菌纲，肉座菌目，肉座菌科，木霉属。

通过纸碟法和毒介质法实验表明：短小芽孢杆菌对深绿木霉菌丝体生长具有较好抑制效果，20μL添加量的纸碟法对菌丝体生长的抑制率达到37%；纸碟法和毒介质法均显示出对深绿木霉产孢子的明显抑制效果。

本发明的积极效果在于：利用短小芽孢杆菌对灵芝深绿木霉病害进行抑制，可以有效防治深绿木霉菌丝体生长速度，尤其是能够有效控制深绿木霉产孢情况。短小芽孢杆菌在抑制灵芝等菌类作物深绿木霉病害中有广泛应用，可在此方面开发新型可湿性粉剂或颗粒状等生物防治菌剂用于灵芝等菌类作物深绿木霉病害的防治。

附图说明：

图1为短小芽孢杆菌菌液对深绿木霉的抑制效果；

图2为CK（含毒介质法的对照组）；

图3为深绿木霉培养中含短小芽孢杆菌毒介质培养结果。

具体实施方式

实施例1

用短小芽孢杆菌按常规的生物防治制剂工艺制成可湿性粉剂或颗粒状菌剂进行灵芝深绿木霉病害的防治，具体试验过程如下：

1.菌株来源

1.1病原菌来源

吉林市蛟河黄松甸镇康芝园灵芝专业合作社灵芝栽培基地，基内菌丝分离后经过遵循柯赫氏法则的回接试验后获得病原菌株。培养病原菌采用PDA培养基（配方：新鲜马铃薯200g，葡萄糖1.0g,琼脂粉20g,H₂O1000mL，pH自然），培养基经121℃灭菌25min后使用。

1.2细菌菌株来源

吉林市蛟河黄松甸镇康芝园灵芝专业合作社灵芝栽培基地周围土壤分离获得，细菌培养基采用LB培养基（配方：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl10g,琼脂粉20g，H₂O1000mL，pH7.4），培养基经121℃灭菌25min后使用。

2.菌株鉴定

2.1病原菌鉴定

通过平板培养物（PDA、CMA、MA、SNA四种培养基）特征、气味、显微特征观察和分子生物学（选用ITS和RPB2两个片段）进行鉴定，最终确定该病原菌为深绿木霉（Trichderma atroviride）。

2.2细菌鉴定

采取生理生化（参照伯杰氏细菌鉴定手册第八版）和分子生物学（16SrDNA）鉴定，最终确定该细菌为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。

3.对峙实验

3.1拮抗菌菌体的抑菌效果测定

3.1.1采用纸碟法的抑菌活性进行测定

在PDA培养基中央接种0.5cm直径的深绿木霉菌饼，其周围3cm处对称放置4个经灭菌的滤纸碟，用移液枪将培养48h所得的短小芽孢杆菌菌也以5μL、10μL、15μL、20μL四个梯度的量注射在滤纸碟上，在26℃下培养，每个实验组做5个重复处理，对照组绿滤纸碟滴加无菌水。观察抑菌效果，并记录。

3.1.2采用含毒介质法的抑菌效果测定

采用含毒介质法测定拮抗物质的抑菌效果。取LB斜面培养基上的短小芽孢杆菌菌株适量接种于LB液体培养基中，在摇床中以30℃，150r/min的条件下培养48h，然后在4℃、1500r/min的条件下离心20min进行粗分离，之后再用0.22μm的微孔滤膜将发酵液中残余的菌体滤去，将所得液体与冷却到近40℃时的PDA固体培养基混合后倒平板。待培养基凝固后在平板中央接种一块深绿木霉菌饼，以添加无菌蒸馏水水为对照组，每个处理5个重复。3天后观测并记录抑菌效果。

3.2对峙实验结果

3.2.1纸碟法结果

纸碟法结果如图1.通过试验分析发现：20μL添加量时短小芽孢杆菌对深绿木霉的菌丝体生长抑制率最高，能够达到37%，且5μL-20μL的菌液均能对深绿木霉产孢进行较好的抑制，而对照组则明显出现产孢现象。参见图1：从左到右依次为：CK、5μL、10μL、15μL、20μL短小芽孢杆菌菌液对深绿木霉的抑制效果

4.2.2含毒介质法结果

含毒介质法结果如图2和图3.通过试验分析发现：添加短小芽孢杆菌发酵滤液的培养基与对照组相比较能够明显抑制深绿木霉的孢子产生。

结论：

短小芽孢杆菌在抑制深绿木霉引起的灵芝病害方面有积极的防治效果，尤其是对深绿木霉孢子产生方面效果明显，在对深绿木霉菌丝体生长上也有较好的抑制效果，并且随着添加量的增加而抑制效果增加。

实施例2

利用短小芽孢杆菌可以制成可湿性粉剂或颗粒状等各种生物防治菌剂。