棉花耐低温发芽鉴定方法与流程

本发明涉及棉花育种领域，具体涉及棉花耐低温发芽鉴定方法。
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：中国棉区“西移北上”已经成为不争的事实，新疆作为我国棉花的主产区，因为其特殊的地理条件和气候环境，低温已经成为限制新疆棉花生产的非生物胁迫因素之一。新疆地区有“前期升温慢、后期降温快”的气候特点，无霜期短且春季气候多变，常有明显的“倒春寒”现象。棉花属于非冷驯化作物，正常生长需足够的热量条件，对低温敏感，生长发育各个阶段均受到低温的影响，特别是在萌发期和幼苗期遭受较低的低温危害，其生育期将显著延迟，现蕾、开花和成熟均推迟，极大地影响最终产量及品质。培育耐低温棉花新品种是重要的途径，因此，开展棉花耐低温种质资源的筛选、鉴定和评价是必经之路。目前，关于棉花耐低温鉴定的研究还很少，缺少统一的鉴定标准和有效的评价体系，成为棉花种质资源耐低温鉴定的重要限制因素。在其它作物中常见低温鉴定报道的有水稻、玉米、小麦等禾本科植物都为单子叶，棉花为双子叶植物，棉花起源于热带和亚热带地区，是一种非冷驯化的植物，这与拟南芥、油菜、大豆等双子叶作物也不同。因此，其他作物中现存的鉴定方法不能直接照搬用到棉花中。技术实现要素：为了探索一种棉花耐低温发芽鉴定方法及有效的评价方法，以期快速有效的对棉花种质资源进行耐低温鉴定，为培育棉花耐低温新品种奠定基础，本发明的发明人提出并完成本发明。本发明的目的是提供棉花耐低温发芽鉴定方法。根据本发明的棉花耐低温发芽鉴定方法，包括以下步骤：1)种子的选择：种子经硫酸脱绒后，选择籽粒饱满成熟的种子；2)种子的预处理：所有种子进行消毒处理；3)低温胁迫处理：将种子摆放在铺有滤纸的高温灭菌的培养皿中，加入适量的纯水，将培养皿放在温度设置为15℃人工气候箱进行暗培养；4)耐低温分级：采用相对萌发率为指标对棉花耐低温水平进行评价，确定其耐低温的水平。具体地，根据本发明的具体实施方式的方法，包括：(1)种子的选择：栽培棉花种子轧花后种壳上仍然存有短绒，种子是否饱满、是否成熟和是否有虫害都不明显，经过硫酸脱绒后，种子外壳上的短绒去掉，挑选乌黑饱满无虫害的完整种子。如果棉花种子是当年新收获的种子，需要破除生理休眠，可以采取加热干燥法，40℃，通风良好，烘箱加热烘干1天。(2)种子的预处理：种子经过硫酸脱绒时会杀死一部分种壳上的微生物，但是在种子处理前仍需进一步进行消毒处理，5％的次氯酸钠溶液浸泡10min，用纯水冲洗干净(4-5遍)。(3)低温胁迫处理(15℃)：将消毒后的种子置于垫有2层滤纸的培养皿中(滤纸和培养皿均已采取高温灭菌处理)，种子最好按照一个方向摆放，种子之间的间隔一定距离，每个培养皿中加入适量的蒸馏水，种子上方再加盖两层湿润的滤纸。发芽期间保持适当的水分，水分过大，易造成种子腐烂；水分过少，种子无法吸收足够的水分从而影响种子萌发。放入设定温度15℃的人工气候培养箱中，对照温度为30℃。每天8h光照，光照强度为13.5μmol/(㎡*s)～22.5μmol/(㎡*s)。人工气候培养箱内的相对湿度接近饱和，连续处理10天。前期为了确定有效的鉴定温度，如果温度太低，所有栽培棉种都不能正常萌发；15℃处理时，材料之间出现明显的差异，不同材料的发芽势和发芽率明显不同；20℃以上的温度，材料与材料之间的差别不大；因此，通过反复摸索，确定15℃为最佳的低温发芽鉴定温度。此外低温胁迫种子发芽速度会减慢，把种子萌发的处理时间延长到10天。(4)耐低温水平分级：参考国家行业标准抗盐鉴定的分级方法(叶武威和刘金定，1998)，计算正常萌发种子占总种子数的比率。正常萌发的种子标准为胚根和下胚轴总长度大于种子长度的两倍，有主根且下胚轴无病，色白，无腐烂变质为正常芽。按照相对发芽率(相对发芽率＝特定低温处理条件下的发芽率/对照温度下的发芽率*100)，进行耐低温水平分级：耐性级别相对出苗率(％)高抗≥90.0抗75.0～89.9耐50.0～74.9感<50.0本发明为棉花耐低温鉴定提供了一种新方法，在国际和国内为独创，具有以下优点：(1)该方法采用相对出苗率进行分级，给出了客观的评价指标，极大降低了人为主观因素造成的误差。(2)该方法采用人工气候培养箱培养，除了设定不同的温度，其他条件在人为控制下均可达到完全一致。减少了环境因素导致的误差，使结果更加可靠。(3)该方法操作简单，人力物力成本低，占用空间少，可进行大批量材料的鉴定。附图说明图1四个栽培棉种的代表材料：草棉(中草1号)、亚洲棉(中亚1号)、陆地棉(中79)、海岛棉(海7124)，低温15℃光照培养箱内，处理10天后，正常萌发的种子。具体实施方式实施例1棉花耐低温发芽鉴定方法鉴定6份棉花材料的耐低温水平1、棉花材料：中亚1号；TM-1，中12，中79；海7124，PM90共6份棉花材料2、种子的选择:硫酸脱绒后的棉花种子，挑选大小一致，乌黑饱满、无虫害的完整的成熟种子。为了确保打破棉花种子的生理休眠，在通风良好的条件下，把供试种子铺成一薄层，40℃，加热烘干24h，以打破种子休眠。保存备用。3、种子的消毒：5％的次氯酸钠溶液浸泡10min，用纯水冲洗干净(4-5遍)。这样可以防止细菌、真菌等引起的种子霉烂。4、低温胁迫处理：设置不同的温度梯度：5℃、10℃、15℃、20℃、25℃，30℃(对照温度)。将消毒后的种子置于垫有2层滤纸的培养皿中(滤纸和培养皿均已采取高温灭菌处理)，种子整齐摆放，种子之间的间隔一定距离，每个培养皿中加入适量的蒸馏水，种子上方再加盖两层湿润的滤纸。发芽期间保持适当的水分。分别放入设定温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃，30℃)的人工气候培养箱中。每天8h光照，光照强度为13.5μmol/(㎡*s)～22.5μmol/(㎡*s)。人工气候培养箱内的相对湿度接近饱和，连续处理10天。每个处理重复3次。5、结果统计及分析：处理后第3天开始调查，20℃及以上的温度处理下，种子开始萌发。15℃低温胁迫下，种子开始露白。5℃和10℃条件下，种子没有萌动。处理10天后，5℃和10℃种子虽有少数观察到萌动露白，但是胚根没有伸长，不算正常发芽。15℃、20℃、25℃、30℃条件下种子都已经完成萌发。统计不同温度下的种子的正常发芽数，通过公式计算相对出苗率，然后根据分级标准进行分级。结果发现，棉花的不同品种的发芽率随着温度降低而减低，在10℃及以下的温度，不能正常萌发；在15℃时不同材料间的发芽率均达到极显著水平，15℃可以作为棉花棉低温胁迫的有效温度。20℃及以上的温度，相同材料的萌发率与对照(30℃)结果稍微有差别，但是差别没有达到显著水平，而且材料之间的差别不大，不能有效的对材料之间的耐低温水平进行鉴别。5、耐低温水平分级：按照棉花耐低温发芽鉴定法的标准，通过公式计算相对出苗率，然后根据分级标准进行分级(见表1)。表16个棉花材料的耐低温水平如图1所示，四个栽培棉种的代表材料：草棉(中草1号)、亚洲棉(中亚1号)、陆地棉(中79)、海岛棉(海7124)，低温15℃光照培养箱内，处理10天后，正常萌发的种子。当前第1页1 2 3