本发明属于鸡胚孵化场环境光照技术领域，具体涉及一种提高鸡胚孵化期骨骼肌卫星细胞增殖活性的方法。
背景技术：
光信息是影响鸡生产力表现的最主要因素之一。有报道显示，鸡群生产力表现的50％-95％取决于环境条件，所以现代养鸡业普遍采用控制光照时间和强度来促进鸡的生产，但利用此方法提高鸡的生产性能不足4％。过去几年间，世界禽肉消费稳步上升，这主要与禽肉价格相对便宜且更易获得有关。在欧美发达国家，胸肉是禽肉中附加值最高的部分，其产量在很大程度上决定着肉禽企业的经济效益。消费者对瘦肉和高品质蛋白的需求也推动着遗传选育工作向增加肌肉产量尤其是胸肌重量的方向发展。
就目前而言，遗传选育的结果是使肉仔鸡生长速度加快，上市日龄不断提前。而肉仔鸡的孵化期也有三周的时间，可见孵化阶段在肉仔鸡的生命周期中所占的比例逐渐增大，如能在胚胎孵化期间采取环境调控措施以促进其骨骼肌生长，将会对提高上市肉仔鸡的肌肉产量具有重要意义。行为学研究表明，禽类具有不同于哺乳动物的优越的视觉机能，不仅有明暗觉，还具有三色视觉。鸡胚孵化第八胚龄时视网膜神经节细胞层即开始发育，可以感受环境光照的变化，并通过视觉传导通路将光信息传导到视觉中枢，影响体内激素水平的变化，从而调节骨骼肌的生长。鸡胚孵化期是骨骼肌卫星细胞的产生和形成时期，可影响骨骼肌的生长发育，而当鸡胚出壳时期肌纤维数量基本恒定，因此在鸡胚孵化期采用环境光照控制以提高骨骼肌卫星细胞增殖活性从而达到生产性能的最大化，对于提高肉鸡肌肉产量具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种提高鸡胚孵化期骨骼肌卫星细胞增殖活性的方法，具体技术方案如下：
一种提高鸡胚孵化期骨骼肌卫星细胞增殖活性的方法：于鸡胚孵化期采用不同颜色的光照进行孵化。
优选地，将0胚龄鸡胚采用不同颜色的光照进行孵化。
所述不同颜色的光照为白色、红色、绿色和蓝色，优选为绿色。
孵化温度保持在37±0.5℃，湿度保持在50％-60％。光照制度为24h全光照，光照强度为15lx。
在测定采用上述方法后骨骼肌卫星细胞的增殖活性时，骨骼肌卫星细胞的分离培养方法为：
1)取刚出壳1日龄的雏鸡，腹腔麻醉后，放入70％酒精中浸泡消毒1min；
2)在超净台内无菌取出雏鸡胸大肌，放入盛有Hank’s液的平皿中涮洗2-3次，除去脂肪组织后放入装有0.5mL EP管中称重；
3)将5mL青霉素瓶预先编号，加入1mL胶原酶I，将分离的胸大肌放入青霉素瓶中进行剪碎，再按2mL/瓶补加胶原酶I；
4)青霉素瓶用封口膜封口，37℃水浴30min。期间不停摇晃，待出现絮状沉淀时终止反应；
5)将液体从青霉素瓶转移至15mL-离心管中，青霉素瓶需用Hank’s液冲洗一并转入，随后1000r/min离心8min，弃上清；
6)将Hank’s液重悬，再一次离心，1000r/min离心8min，弃上清；
7)用3mL 0.25％胰酶重悬，放37℃水浴20min，期间不停摇晃，以快速从基底膜释放细胞；
8)用完全培养基终止胰酶作用，吹打混匀；
9)将混合液过200目筛网，用磨棒研磨，Hank’s液冲洗筛网一次，将小烧杯收集的滤液转移至离心管中，小烧杯用Hank’s液冲洗一次，一并转入。随后1000r/min离心5min，弃上清；
10)DMEM基础培养基重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清；
11)DMEM完全培养基重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清；
12)DMEM完全培养基重悬细胞，将重悬液移至细胞瓶中；
13)经1h差速贴壁，去除成纤维细胞；
14)用5％台盼蓝染液进行细胞计数，调整细胞浓度为6×106个/mL，将细胞悬液加入至含有细胞爬片的6孔板中，或96孔板(100μL/孔)，放入37℃培养箱中继续培养。
本发明具有以下有益效果：本发明通过提高鸡胚孵化期骨骼肌卫星细胞增殖活性，有效提高了肉鸡出壳时的体重，以及出壳后骨骼肌抗氧化水平，改善了肉品质。解决了现有鸡胚孵化及肉鸡饲养技术所存在的以下问题：1)鸡胚出壳时体重轻，孵化率低；2)向饲料中添加抗生素、饲料添加剂和延长光照时间及增加光照强度以刺激其采食量来提高肉鸡的生产性能；3)以上技术手段所造成的药物残留、病原菌的耐药性和免疫应激造成的动物生产性能下降，以及动物源性食品安全问题。
具体实施方式
1.鸡胚的孵化及雏鸡的饲养
将0胚龄AA肉鸡(Arber Acres)鸡胚用75％酒精擦拭消毒后随机均匀放置于5种环境光照的孵化器中，分别是无光源的黑暗孵化箱、装有白色LED灯(440nm-760nm)的白光孵化箱、装有红色LED灯(660nm)的红光孵化箱、装有绿色LED灯(560nm)的绿光孵化箱和装有蓝色LED灯(480nm)的蓝光孵化箱。孵化箱为自动孵化装置，孵化过程受严格控制，孵化温度保持在37±0.5℃，湿度保持在50％-60％。孵化期间每2h自动翻蛋一次，光照制度为24h全光照，光照强度为15lx。出壳后将不同处理组雏鸡转入白光环境的饲舍饲养，自由采食和饮水，光照制度为23L:1D，光照强度为鸡头水平方向15lx，舍内温度为32℃，湿度50％-60％。试验过程中使用数字式照度计进行光照强度检测。
2.鸡原代骨骼肌卫星细胞的分离培养
1)取刚出壳1日龄的雏鸡，腹腔麻醉后，放入70％酒精中浸泡消毒1min。
2)在超净台内无菌取出雏鸡胸大肌，放入盛有Hank’s液的平皿中涮洗2-3次，除去脂肪组织后放入装有0.5mL EP管中称重。
3)将5mL青霉素瓶预先编号，加入1mL胶原酶I，将分离的胸大肌放入青霉素瓶中进行剪碎，再按2mL/瓶补加胶原酶I。
4)青霉素瓶用封口膜封口，37℃水浴30min。期间不停摇晃，待出现絮状沉淀时终止反应。
5)将液体从青霉素瓶转移至15mL离心管中，青霉素瓶需用Hank’s液冲洗一并转入。随后1000r/min离心8min，弃上清。
6)将Hank’s液重悬，再一次离心，1000r/min离心8min，弃上清。
7)用3mL 0.25％胰酶重悬，放37℃水浴20min，期间不停摇晃，以快速从基底膜释放细胞。
8)用完全培养基终止胰酶作用，吹打混匀。
9)将混合液过200目筛网，用磨棒研磨，Hank’s液冲洗筛网一次，将小烧杯收集的滤液转移至离心管中，小烧杯用Hank’s液冲洗一次，一并转入。随后1000r/min离心5min，弃上清。
10)DMEM基础培养基重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清。
11)DMEM完全培养基重悬细胞，1000r/min离心5min，弃上清。
12)DMEM完全培养基重悬细胞，将重悬液移至细胞瓶中。
13)经1h差速贴壁，去除成纤维细胞。
14)用5％台盼蓝染液进行细胞计数，调整细胞浓度为6×106个/mL，将细胞悬液加入至含有细胞爬片的6孔板中，或96孔板(100μL/孔)，放入37℃培养箱中继续培养。
3.鸡骨骼肌卫星细胞的鉴定
将培养至24h的细胞从培养箱中取出，于倒置显微镜下观察其形态。此时，分离的细胞已贴壁，细胞呈梭形或纺锤形，有两极，单核，具有一定的折光性。少数细胞呈现多角形，有突起，彼此联结成网。
待贴壁细胞约占爬片的80％时，用95％酒精固定细胞20min，利用免疫细胞学法对培养的细胞进行鉴定。本方法中采用Desmin(结蛋白)对骨骼肌卫星细胞进行鉴定。(Desmin为肌细胞内细胞骨架中间丝的构成成分之一，可作为骨骼肌卫星细胞的鉴定指标)。具体步骤如下：
1)将细胞爬片用0.01mol/L PBS缓慢漂洗3次，5min/次；
2)5％正常驴血清(含0.1％Triton-100)室温孵育20min；
3)在细胞爬片上加入小鼠抗猪Desmin抗体(1:50)，4℃孵育过夜；
4)复温后PBS漂洗3次，5min/次；
5)加罗丹明标记的驴抗小鼠IgG(1:100)，室温孵育2h；
6)PBS漂洗3次，5min/次；
7)加入DAPI染色液(5μg/mL)，室温孵育2min；
8)PBS漂洗3次，5min/次；
9)甘油封片，置于荧光显微镜下观察。
免疫细胞染色结果显示，Desmin染色结果呈阳性，阳性细胞胞质着红色荧光，说明本方法分离培养的细胞为鸡骨骼肌卫星细胞。
4.鸡骨骼肌卫星细胞增殖活性的检测
将96孔板中原代骨骼肌卫星细胞培养至24h后，弃上清，分别向每孔添加10μL 5mg/mL MTT，培养4h；随后添加100μL 10％SDS，置于37℃温箱中孵育2h，用570nm酶标仪测定OD值。
5.添加不同浓度的外源性IGF-1对鸡骨骼肌卫星细胞增殖活性的影响
1)用不含血清的DMEM培养基配制含0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的IGF-1工作液；
2)将96孔板中原代骨骼肌卫星细胞培养至24h后，弃上清，分别添加100μL不同浓度的IGF-1工作液，对照组添加无血清的DMEM培养基，相同条件下继续培养48h；
3)每孔添加10μL 5mg/mL MTT，培养4h；
4)每孔添加100μL 10％SDS，置于37℃温箱中孵育2h，用570nm酶标仪测定OD值。实施例1：
本方法将不同光色环境孵化的出壳1日龄雏鸡进行称重，并取胸大肌制作石蜡切片、HE染色，统计胸肌肌纤维面积。结果发现，与其他处理组相比，孵化期绿光照射能显著提高雏鸡体重(3.39％-30.32％)，促进肌肉生长(4.79％-24.39％)和增加肌纤维面积(15.12％-45.26％)。实施例2：
本方法将不同光色环境孵化的出壳1日龄雏鸡进行心脏采血，检测血浆中IGF-1含量，发现孵化期绿光照射能显著提高雏鸡血浆IGF-1含量，且比其他处理组高22.16％-47.17％。实施例3：
本方法中将不同光色环境孵化的出壳1日龄雏鸡的骨骼肌卫星细胞分离培养，发现鸡胚孵化期用绿光照射能显著提高出壳后雏鸡骨骼肌卫星细胞的增殖活性，且比黑暗组、白光组、红光组和蓝光组提高4.76％-37.50％。
实施例4：
分别向细胞培养液中添加浓度为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL的外源性IGF-1，均能显著促进雏鸡骨骼肌卫星细胞的增殖活性，且随IGF-1浓度的增加细胞增殖活性也随之升高，其中以添加100ng/mL的IGF-1浓度最佳。当向分离培养的不同光色环境孵化的出壳1日龄雏鸡的骨骼肌卫星细胞中添加100ng/mL IGF-1，绿光组骨骼肌卫星细胞增殖活性比黑暗组、白光组、红光组和蓝光组高14.81％-29.17％。
实施例5：
本方法取不同光色环境孵化的出壳1日龄雏鸡的胸大肌，用抗氧化试剂盒检测胸大肌抗氧化水平，发现孵化期用绿光照射能提高出壳后雏鸡骨骼肌抗氧化酶GSH-Px和SOD活性、以及总抗氧化能力T-AOC水平，降低脂质过氧化物MDA含量，从而提高了雏鸡骨骼肌的抗氧化能力，减少自由基和脂质过氧化物对细胞的损伤，进而促进骨骼肌卫星细胞的增殖活性和骨骼肌的生长。