本发明属于农业化学领域，尤其是涉及壳寡糖在植物组织培养及快速繁殖的应用。
背景技术：
：组织培养是在人为创造的无菌条件下将生活的离体器官(如根、茎、叶、茎段、原生质体)、组织或细胞置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术。这种技术已广泛应用于农业和生物、医药的研究。以经济型观赏花卉红掌为例，通过组织培养技术生产红掌种苗主要有再生体系的建立、增殖培养、壮苗生根、移栽和温室育苗等技术环节。现阶段的组织培养生产实践中，普遍存在着繁殖系数偏低、继代培养周期偏长等问题。目前为解决这些问题，一般都会使用不同浓度的激素配比来改善繁殖系数，尽可能缩短培养周期。申请人利用加入壳寡糖的MS培养基进行组织培养，对诱导愈伤组织形成、提高繁殖系数、加快试管苗繁殖速度方面都有非常好的效果，以此可以大大提高植物组培繁殖的效率。技术实现要素：为了克服现有技术中的不足，本发明提供壳寡糖在植物组织培养及快速繁殖的应用，能够显著提高愈伤组织萌动率，缩短愈伤组织形成时间，缩短继代周期，有利于缩短组培植物的繁育时间，提高经济效益。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：壳寡糖作为生长剂添加到培养基中，壳寡糖可以是干粉、溶液或者其他可溶于水的剂型。作为优选，上述壳寡糖溶液浓度为5～25ppm。作为优选，上述培养基为MS培养基，方便植物愈伤组织的生长。在植物组织培养的再生体系建立阶段、增殖培养阶段和壮苗生根阶段都需要用到MS培养基，而使用加入壳寡糖成分的改良MS培养基能够比不加壳寡糖成分的普通MS培养基效果更好，整体周期更短。上述用途中，MS培养基的具体成分因培养对象而异。这是因为不同植物对激素的敏感性不同。但其主要成分内容不变，只是激素浓度配比不同。此外，本研究发现，利用添加壳寡糖的MS培养基接种外植体，在26℃±2℃、光照1500～2000Lx×12h/d条件下培养，诱导愈伤组织形成时间可以缩短四分之一。而继续利用壳寡糖MS培养基进行分化培养，分化培养时间也可缩短四分之一，分化率有显著提高。对于一般植物而言，壳寡糖已知具有促进根茎生长、促进根系数目增多的功效。而组织培养正是指植物各部分组织如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，以往都是利用不同浓度配比的植物生长调节物质，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(萘乙酸)、6-苄基嘌呤(6-苄氨基腺嘌呤)等完成植物各部分组织的退分化形成愈伤组织，然后愈伤组织再分化进而生长出完整植物体。本申请发现壳寡糖能够作为小分子诱导物质，正向调节组织培养的各个过程。本发明壳寡糖在植物组织培养及快速繁殖的应用是基于以下原理进行的：植物组培的过程原理分为两部分，一是外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。二是产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。愈伤组织形成的过程中，外植体细胞需要经过诱导后脱分化，不断分裂、增生子细胞。这种诱导需要一定的植物激素，加入壳寡糖的ms培养基在诱导愈伤组织形成方面有着一定功效。其原理有待进一步研究，根据现有资料推测，可能是由于壳寡糖作为一种小分子糖类，可与细胞原生质膜上的特定受体(糖蛋白)相互作用，激活信号传导，促进相关基因的转录与表达。通过自身诱导产生的内源激素其效果要好于外源激素添加。另外，在组织培养过程中的酚污染会影响培养效果。酚污染程度与外植体细胞的多酚氧化酶活性有关。培养过程中的酚污染程度常随细胞分裂素浓度的提高而加重。继代培养过程中因为培养基环境恶化也会导致愈伤组织出现老化、粘化及不正常分化等现象。壳寡糖是一种具有正电荷的小分子物质，可以吸附毒性物质，间接保护愈伤组织的继代培养过程。在本发明中，壳寡糖为氨基葡萄糖通过1,4-糖苷键连接而成的聚合度为2-30的高分子聚合物的混合物，平均分子量为1000-3000道尔顿。壳寡糖可以通过任意方法制备，例如如下的方法：脱乙酰度在70％以上的壳聚糖通过物理降解法、化学降解法、酶降解法、糖基转移法、复合降解法等方法制备得到的聚合度为2-30的低聚壳寡糖的混合物。或者，通过从真菌细胞壁中提取得到甲壳素并通过物理降解法、化学降解法、酶降解法、糖基转移法、复合降解法等方法制备得到的聚合度为2-30的低聚壳寡糖混合物。或者，通过由氨基葡萄糖通过1,4-糖苷键化学合成聚合度为2-30的低聚壳寡糖混合物。目前壳寡糖均为不同聚合物的高分子聚合物的混合物。也就是说壳寡糖中并不是单一聚合度的寡糖形式。而是每种聚合度的壳寡糖但汤都可能存在。所以无论通过何种方法制备得到，或者通过上述制备方法制备得到的市售产品，只要其是氨基葡萄糖通过1,4-糖苷键连接而成的聚合度为2-30、平均分子量为1000-3000道尔顿的高分子聚合物的混合物就是本发明所述的壳寡糖，其可以含有乙酰基，但是键合乙酰基的糖单元不超过40％的量，优选不超过30％的量，尤其优选不超过20％的量。本发明将壳寡糖加入MS培养基中，加入壳寡糖的MS培养基能够加快诱导组织培养过程中愈伤组织的形成，并且加快试管苗繁殖速度以缩短继代时间。本发明壳寡糖对诱导愈伤组织形成、提高繁殖系数、加快试管苗繁殖速度方面都有非常好的效果，并以此可以大大提高植物组培繁殖的效率。具体实施方式为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限于本发明。实施例以观赏花卉红掌为例，利用红掌的茎段作为最初培养诱导材料(即外植体)进行以下步骤。将外植体表面的灰尘用毛刷刷干净，流水冲洗干净，紫外灯照射10min。转入超净工作台中，用75％的酒精洗涤约30秒钟，无菌水冲洗，然后用0.1％的升汞灭菌10-15分钟，用无菌水充分洗涤，去除灭菌液。用经过灭菌的滤纸吸去表面水分，切成适宜的大小。将上述得到的外植体分别接种于实验组壳寡糖改良MS培养基和对照组MS培养基中培养。记录诱导出可用的愈伤组织(产生大约2cm左右的芽)的平均时间。其中，对照MS培养基是在常规MS培养基的基础上添加了6-苄氨基腺嘌呤1.5ml/L，激动素1.0mg/L。壳寡糖改良MS培养基是在常规MS培养基基础上添加了6-苄氨基腺嘌呤1.5ml/L，激动素1.0mg/L以及5～25ppm壳寡糖。形成愈伤组织后，选取长势基本一致的红掌试管苗分别接入两组不同1/2MS培养基中进行继代培养。其中壳寡糖改良1/2MS培养基是在常规MS培养基的基础上添加萘乙酸0.2mg/L,吲哚乙酸2.0mg/L,活性炭0.2％以及5～25ppm壳寡糖，对照1/2MS培养基是在常规MS培养基的基础上添加萘乙酸0.2mg/L,吲哚乙酸2.0mg/L,活性炭0.2％。继代培养后过程中，会不断长出芽苗，当增殖到一定量时，可降低激素的量如用0.1-0.2ml/L6-苄氨基腺嘌呤，促进芽苗长大长壮，并长出气生根。壮苗培养1-2代后，分别转入附加0.1毫克/升吲哚乙酸或萘乙酸的对照1/2MS培养基和壳寡糖改良1/2MS培养基上促进根的形成；统计从继代培养开始至根系形成至3～4厘米时所用的时间。表1不同MS培养基对红掌茎段愈伤组织诱导的时间(d)MS培养基中壳寡糖浓度调查茎段愈伤组织诱导率平均诱导时间5ppm504182％37d15ppm503774％39d25ppm503468％44d对照MS培养基502856％52d表2不同1/2MS培养基对红掌愈伤组织增殖培养至可移栽所用时间(d)。MS培养基中壳寡糖浓度所用平均时间5ppm39d15ppm41d25ppm41d对照1/2MS培养基49d从表1和表2中可以看出，使用壳寡糖的MS培养基可以显著提高植物组培繁育的效率加快生产进度。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。当前第1页1 2 3