本发明涉及植物组培领域，特别涉及一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法。
背景技术：
舌柱唇柱苣苔(Chirita liguliformis W.T.Wang)是苦苣苔科(Gesneriaceae)唇柱苣苔属多年生草本。舌柱唇柱苣苔具粗根状茎，叶片基生，对生，长2-11厘米，宽4-9毫米，被短柔毛。叶片厚纸质，椭圆形。花序约2条，2-3回分枝，每花序约有7花；花序梗长20厘米，被开展短柔毛，花期7月；苞片狭三角形，长约3.5毫米，宽1.1毫米，被短柔毛；花梗长2.5-4厘米，被短柔毛。花萼5裂达基部，裂片披针状线形，长3-3.5毫米，宽1毫米，外面被短柔毛，内面无毛。花冠淡紫色，长约2.2厘米，外面疏被短柔毛，内面在上唇之下被短柔毛；筒长约1.5厘米，口部直径约6毫米。蒴果线形，长约3厘米，宽2毫米，被短柔毛；种子椭圆形，长约0.25毫米。产贵州西南部(安龙、册享)。生于山谷林下阴湿处，海拔约800米。
舌柱唇柱苣苔的花色素雅，其叶片厚，十分耐阴，易于管理，将其开发为室内观赏花卉和园林绿化耐阴花卉具有较高的市场价值，然而野生资源十分稀少，难以满足市场上将其作为观赏花卉和园林绿化的实际需要。植物组织培养是一种快速繁殖技术，可为园艺市场提供大量优质种苗，同时也避免了采挖野生舌柱唇柱苣苔对野生资源的破坏。
技术实现要素：
本发明提供一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法，以解决野生舌柱唇柱苣苔难以满足市场上将其作为观赏花卉和园林绿化的实际需要，有效、快速的提高种苗的繁殖速度和保证种苗的繁殖质量，为舌柱唇柱苣苔作为室内观赏花卉和园林耐阴花卉提供了大量优质种苗。
本发明的技术方案如下：
一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体的制备
取舌柱唇柱苣苔的叶片，经清洗、消毒和漂洗，得到外植体；
(2)初代培养
所述的外植体接种到添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.05～0.1mg/L NAA的MS培养基中培养，所述的外植体的边缘出现大量不定芽，继续培养至不定芽发育成幼株；
(3)继代培养
所述的幼株在无菌条件下取出，将所述的幼株的叶片切成小块，然后所述的小块接种到添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.01～0.05mg/L NAA的MS培养基中培养，所述的小块出现不定芽，继续培养至不定芽全部成幼苗；
(4)生根培养
所述的幼苗转接到添加有0.1～0.3mg/L IBA和15～30g/L蔗糖的MS生根培养基中培养，得到生根苗；
(5)移栽驯化
所述的生根苗从培养装置内移出，移栽于装满育苗基质的育苗容器培养，并控制相对湿度，得到定植苗。
进一步优选，所述的步骤(1)外植体的制备包括取舌柱唇柱苣苔的幼嫩叶片，用洗涤剂擦洗后，置于水下冲洗，然后将叶片置于超净台下，剪成边长约1cm的小方块，所述的小方块依次的用70％酒精清洗，无菌水冲洗，并移入加有一滴吐温20的0.1％升汞溶液中，取出后再用无菌水漂洗，得到所述的外植体。
进一步优选，所述的步骤(2)初代培养的MS培养基添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，且pH为5.8。
进一步优选，所述的步骤(2)初代培养的培养条件为在温度为25±2℃，先黑暗下培养，然后再移置于光合有效辐射为40μmol m-2s-1，光照时间12h下培养。
进一步优选，所述的步骤(3)继代培养还包括待不定芽全部成幼苗时，及时分株转接到新的添加有0.1～0.5mg/L 6-BA和0.01～0.05mg/L NAA的MS培养基中继续培养，然后再进行生根培养。
进一步优选，所述的步骤(3)继代培养的MS培养基添加有0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，且pH为5.8。
进一步优选，所述的步骤(3)继代培养和所述的步骤(4)生根培养的培养条件均是在温度25±2℃，光合有效辐射为40μmol m-2s-1，光照时间12h下培养。
进一步优选，所述的步骤(4)生根培养的MS培养基添加有0.3mg/L IBA、30g/L蔗糖、5.5g/L琼脂，且pH为5.8。
进一步优选，所述的步骤(5)移栽驯化的育苗基质为体积比3:1:1的草炭、蛭石和珍珠岩，且pH为6.5。
进一步优选，所述的步骤(5)移栽驯化包括将所述的生根苗从培养瓶内移出，洗去附着于根部的培养基溶液，然后移栽于装满有育苗基质的孔穴盘中，每穴一株，放置于苗床上，移栽后温室遮阳，最大光合有效辐射不高于160μmol m-2s-1，并定期喷雾保湿，温度控制在15～30℃下培养，驯化后再移栽。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
一、本发明的一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法，有效、快速的提高了种苗的繁殖速度和保证了种苗的繁殖质量，为舌柱唇柱苣苔作为室内观赏花卉和园林耐阴花卉提供了大量优质种苗，通过初代培养和继代培养得到数目众多的幼苗，繁殖系数高，且经生根培养后，生根苗的移栽成活率达到95％以上。
二、本发明的一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法，分别对初代培养、继代培养和生根培养的MS培养基所加入的激素等物质和其含量进行了优化，得到了组培快繁各阶段培养时的特定培养基，提高了繁殖系数和保证了繁殖质量。
当然，实施本发明的任一方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明的一种舌柱唇柱苣苔的组培快繁方法，具体包括以下步骤：
(1)外植体的制备
天气晴朗时，引种成活且生长健壮的舌柱唇柱苣苔母株，置于通风处，一周后取幼嫩的叶片，用洗洁精轻轻擦洗后，置于流动的自来水下冲洗1小时，然后将叶片放置于超净台下，剪成边长约1cm的小方块，先用70％酒精清洗10s，再用无菌水冲洗3次(每次15s左右)，再移入加有一滴吐温20的0.1％升汞溶液中，振荡5-8分钟，最后用无菌水漂洗7-10次，得到所述的外植体；
(2)初代培养
所述的外植体接种到添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，且pH为5.8的MS培养基中培养，每瓶约接种5个，培养室温度为25±2℃，先黑暗培养一周，然后再移置于光合有效辐射(PAR)为40μmol m-2s-1的组培架上，光照时间12h，培养19天，所述的外植体的边缘出现大量不定芽，芽粗壮密集，继续培养至第6周，不定芽发育为完整但未生根的幼株；
(3)继代培养
所述的幼株在超净工作台无菌条件下取出，将幼株的叶片剥下并切成0.5cm×0.5cm的小块，然后所述的小块接种到添加有0.5mg/L 6-BA和0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，且pH为5.8的MS培养基中培养，每瓶接种5个，培养室温度为25℃±2℃，光合有效辐射为40μmolm-2s-1，光照时间12h下培养，培养3周后，所述的小块出现不定芽，继续培养3周，不定芽全部成幼苗，再及时的分株，转接到新的添加有0.5mg/L 6-BA、0.01mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂的MS培养基中继续培养3周，获得健壮的植株；
(4)生根培养
所述的植株转接到添加有0.3mg/L IBA、30g/L蔗糖和5.5g/L琼脂，且pH为5.8的MS生根培养基中培养25-30天，得到生根完整的生根苗，根长约1cm，植株长至3-4cm高；
(5)移栽驯化
将所述的生根苗从培养瓶内移出，洗去附着于根部的培养基溶液，然后移栽于装满有育苗基质的72孔穴盘中，每穴一株，放置于苗床上，苗床覆盖小拱棚，小拱棚内配备喷雾装置，定期喷雾保湿，所述的育苗基质为体积比3:1:1的草炭、蛭石和珍珠岩，且pH为6.5，装满穴盘后浇透水；移栽后温室遮阳，小拱棚内的光合有效辐射不高于160μmol m-2s-1的，驯化第一周，小拱棚内的空气相对湿度通过喷雾装置和拱棚控制在95％以上，拱棚薄膜全封闭，一周后，新根长出后逐步揭开拱棚薄膜，并将空气相对湿度保持在85％以上，维持一周，然后再加大通风面积，空气湿度逐步降到75％，温室内的温度控制在15～30℃下培养，驯化栽培6周后，可将穴盘苗进一步移栽于花盆。
为了进一步考察在初代培养、继代培养和生根培养，各培养基对舌柱唇柱苣苔的组培快繁的影响，本发明还设置了若干组实验以优化在培养各阶段的培养基。
一、考察初代培养时，培养基配方对不定芽诱导的影响
将所述的外植体分别接种到以下各组培养基中培养，第一组：0.5mg/L 6-BA、6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基；第二组：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基；第三组：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L IBA、6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基；第四组：0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基，每组各设置一个培养瓶，每个培养瓶均接种5个外植体，每个培养瓶的培养条件均为培养室温度25±2℃，先黑暗培养一周，然后再移置于光合有效辐射(PAR)为40μmolm-2s-1的组培架上，光照时间12h下培养，统计结果如表一所示。
表一
注：表中第三列数据的不同字母(a、b)标注，表示新复极差法检验有显著差异(P<0.05)
从表一的数据分析可以看出，第一组培养26天后，外植体增厚，但未见明显的愈伤组织，边缘出现不定芽且芽粗壮，但每个外植体只出现19个不定芽；第二组培养19天后即出现不定芽，每个外植体共产生31个不定芽，芽体比较均匀；第三组和第四组的每个外植体产生不定芽数分别为25个和23个，且产生不定芽的时间也相应的比第二组要长，因此，本发明在初代培养时，培养基宜选用添加有0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基。
二、考察不同激素水平组合对舌柱唇柱苣苔继代培养增殖的影响
将所述的小块分别接种到表二所示的组别为1～10的培养基上，第1组为对照组，不加任何激素的MS培养基，第2～10组为实验组，在MS培养基中所加入的激素如表二第二列所示，其中每一组培养基中都还加入了6g/L琼脂、30g/L蔗糖，且pH为5.8，每组各设置一个培养瓶，每个培养瓶均接种5个小块，每个培养瓶的培养条件均为培养室温度为25℃±2℃，光合有效辐射为40μmolm-2s-1，光照时间12h下培养，统计结果如表二所示。
表二
注：表中第三列数据的不同字母(a、b、c、d)标注，表示新复极差法检验有显著差异(P<0.05)
从表二的数据分析可以看出，MS培养基中的6-BA的浓度对不定芽产生数量有显著影响(P＝0.005)，而NAA的浓度对其没有显著影响(P＝0.247)，两种激素的交互作用也对其有显著影响。每个小块产生的不定芽数量总体随6-BA浓度的升高而增多，但6-BA浓度过高，芽密集且小，而且芽体玻璃化现象严重，因此，综合增殖系数和苗体质量，本发明在继代培养时，宜选用添加有0.5mg/L的6-BA，0.01mg/L NAA，6g/L琼脂，30g/L蔗糖，且pH为5.8的MS培养基。
三、考察不同激素水平和蔗糖含量对舌柱唇柱苣苔生根培养的影响
将所述的幼苗分别接种到表三所示的组别为1～6的培养基上，具体考察了蔗糖浓度和IBA浓度对幼苗生根培养的影响，具体各浓度如表三第二、三列所示，其中每一组培养基中都还加入了5.5g/L琼脂，且pH为5.8，每组各设置一个培养瓶，每个培养瓶均接种5个小块，每个培养瓶的培养条件均为培养室温度为25℃±2℃，光合有效辐射为40μmolm-2s-1，光照时间12h下培养，统计结果如表三所示。
表三
注：表中第三列数据的不同字母(a、b、c、d)标注，表示新复极差法检验有显著差异(P<0.05)
从表三的数据分析可以看出，蔗糖的浓度对瓶苗株高和根数有显著影响，IBA的浓度对瓶苗叶片数、根数、根长和株高都有显著影响，其中在相同蔗糖的浓度下，在加入有0.5mg/L IBA的培养基培养时，根数为最多，根长也最长，植株也最高，但是瓶苗的根细长且不均匀，苗体也较弱，因此，在相同蔗糖的浓度下，宜选用0.3mg/L IBA的培养基；在相同IBA的浓度下，在加入30g/L蔗糖培养时，瓶苗较为健壮，根均匀且粗壮，根长约15mm,，植株长至1.5-2cm高，易于移栽。因此，本发明在生根培养时，宜选用0.3g/L IBA、5.5g/L琼脂、30g/L蔗糖且pH为5.8的MS培养基。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。