本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种抑制青花菜组培苗内生菌污染的方法。
背景技术：
青花菜( Brassia oleracea L. var. varitalica Planch) 又名西兰花、绿菜花、嫩茎青花菜，为十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，富含多种维生素、矿物质和天然防癌抗癌物质，是营养价值很高的蔬菜。青花菜起源于地中海沿岸，国内种质资源匮乏，种子价格昂贵，国外优良种质又难以获得，这些因素制约着国内青花菜多类型优良品种选育工作的开展。优质、抗逆、抗病品种的培育一直是育种家关注的热点问题之一。而培育优良品种的首要关键是选育具备目标特性的青花菜种质资源。
关于青花菜的组织培养、快繁的研究最早见于国外的Anderson（1977）和Johnson（1978）。而在国内，李曙轩等（1983）利用叶片、中肋等外植体的组培，在基本培养基MS内附加一定量的激素配比的条件下已取得了不错的效果；张丽丽等（2008）以青花菜带柄子叶为外植体，研究其高频离体再生体系，获得了较高的再生频率均高于80%。
在植物组织培养中，由于材料内部（细胞内或胞间)的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料带入培养过程，引起的污染称为内生细菌污染或内源细菌污染。这些内生细菌就会生长出来并引起程度不一的污染，产生程度不一的危害。很多科研人员采用外植体预处理、培养基中添加抗生素等技术手段，以达到抑制内生菌污染的目的。但是使用抗生素可能对哺乳类动物有害；若是使用生长期较长的植物，微生物亦有抗药性产生；而且容易错误使用，比如没有针对微生物而使用各种不同的抗生素。针对青花菜和结球甘蓝的组织培养，增殖培养基中的细胞分裂素6-BA也会促使组培苗中的内生菌释放到培养基中，形成污染。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种抑制青花菜组培苗内生菌污染的方法，实现对青花菜材料的保存和扩繁，以满足育种和生产上的需要。
本发明采用以下技术方案:
一种抑制青花菜组培苗内生菌污染的方法，包括以下步骤：取种子或腋芽作外植体，在自来水下冲洗30～60分钟，后用吸水纸吸干外植体表面水分，置于无菌培养瓶中用浓度为75%的乙醇针对灭菌30～60秒，再用灭菌剂消毒13～20分钟，后用无菌水冲洗3～5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25±2℃培养室中培养；培养20～25天时，分离新幼芽无菌转接到增殖培养基中继续培养；将出现内生菌污染的再生苗转接到生根培养基中培养，后再转接至同类生根培养基培养直至生根；所述的生根培养基为1/2 MS+0.1～0.15 mg/L IBA+0.1～0.2 mg/L NAA，含20～30%蔗糖，0.8～1.0%琼脂，0.1-0.2‰易培隆，pH值为5.8～6.0。
本方法采用连续多次把内生菌污染组培苗转接到添加易培隆的生根培养基中培养的方法，以达到保持组培苗健康生长、生根的目的。
作为优选，所述的外植体冲洗方法为：在自来水下冲洗30～60分钟，后用吸水纸吸干外植体表面水分后灭菌。
作为优选，所述的灭菌方法为：将外植体置于无菌培养瓶中用浓度为75%的乙醇针对灭菌30～60秒，再用灭菌剂消毒13～20分钟，后用无菌水冲洗3～5次。
作为优选，所述种子外植体颗粒饱满、无病虫害，腋芽外植体为新长出的带柄幼嫩花球，包含至少一个芽点。
作为优选，所述灭菌剂是体积分数为0.1%氯化汞或5～10%次氯酸钠溶液。
作为优选，所述用灭菌剂对外植体进行灭菌时，不断反复震荡使得外植体充分接触灭菌剂。本发明不断反复震荡青花菜外植体，使其充分接触灭菌剂，可以提高灭菌效果。
作为优选，所述增殖培养基为MS+2～3mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L NAA，含20～30%蔗糖，0.8～1.0%琼脂，pH值为5.8～6.0，其中NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基腺嘌呤。本发明的增殖培养基中的NAA可以促使组培苗生根，封闭内生菌释放到培养基的通道。
作为优选，所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
作为优选，所述内生菌污染表现为新生组培苗根部总是出现细菌污染。
作为优选，所述发现组培苗根部出现细菌污染时，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培养基培养7～10天，连续转接3～5次直至生根。
有益效果：
1）本发明的易培隆有利于抑制内生菌生长和扩散，把受到内生菌污染的组培苗多次转接到加有易培隆的生根培养基中培养生根，可以很好的抑制内生菌污染，获得数量较多的组培苗。
2）本方法具有操作简便、繁殖效率高等优点。
3）本方法可以降低组培苗内生菌污染率50%以上。组培苗再生植株与种子实生苗在田间表现相比，没有明显差异。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不局限于此。
实施例1
增殖培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.8%琼脂，0.1‰ 易培隆，pH值为5.8；生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.8%琼脂，0.1‰ 易培隆，pH值为6.0。
所述的生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.1 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.8%琼脂，0.1‰易培隆，pH值为6.0。
所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球（包含至少一个芽点），在实验室超净工作台上用解剖刀切成3cm的小块，用浓度为75%的乙醇在其表面灭菌30秒，再用体积分数为5%的次氯酸钠溶液消毒18分钟，用无菌水冲洗5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于23℃培养室中培养，培养20天时形成新芽；转接内生菌污染新芽到生根培养基中培养，培养7天后再次转接到新是生根培养基中培养10天，后再次转接到此生根培养基中培养30天，组培苗最后形成了健康根系，内生菌污染得到了有效抑制。
结果：本方法降低了组培苗内生菌污染率55%。
实施例2
增殖培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.9%琼脂，0.15‰ 易培隆，pH值为5.8；生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.9%琼脂，0.15‰ 易培隆，pH值为5.9。
所述的生根培养基为1/2 MS+0.15 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA，含30%蔗糖，1.0%琼脂，0.2‰易培隆，pH值为5.9。
所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
以青花菜种子作外植体（外植体颗粒饱满、无病虫害），用浓度为75%的乙醇在其表面灭菌45秒，再用体积分数为0.1%的氯化汞溶液消毒13分钟，用无菌水冲洗5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25℃培养室中培养，培养25天时形成新芽；转接内生菌污染新芽到生根培养基中培养，培养10天后再次转接到新是生根培养基中培养10天，后再次转接到此生根培养基中培养30天，组培苗最后形成了健康根系，内生菌污染得到了有效抑制。
结果：本方法降低了组培苗内生菌污染率65%。
实施例3
增殖培养基为：MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.05mg/L，含20%蔗糖，0.9%琼脂，0.2‰ 易培隆，pH值为6.0；生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA，含20%蔗糖，0.9%琼脂，0.2‰ 易培隆，pH值为6.0。
所述的生根培养基为1/2 MS+0.13 mg/L IBA+0.15mg/L NAA，含25%蔗糖，0.9%琼脂，0.15‰易培隆，pH值为5.8。
所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球（包含至少一个芽点），在实验室超净工作台上用解剖刀切成3cm的小块，用浓度为75%的乙醇在其表面灭菌30秒，再用体积分数为10%的次氯酸钠溶液消毒18分钟，用无菌水冲洗5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于23℃培养室中培养，培养20天时形成新芽；转接内生菌污染新芽到生根培养基中培养，培养10天后再次转接到新是生根培养基中培养15天，后再次转接到此生根培养基中培养30天，组培苗最后形成了健康根系，内生菌污染得到了有效抑制。
结果：本方法降低了组培苗内生菌污染率55%。
实施例4
生根培养基：1/2 MS+0.14 mg/L IBA+0.1mg/L NAA，含22%蔗糖，0.8%琼脂，0.2‰易培隆，pH值为6.0。
增殖培养基：MS+2.5mg/L 6-BA+0.08mg/L NAA，含25%蔗糖，1.0%琼脂，pH值为6.0，其中NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基腺嘌呤。
所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
一种抑制青花菜组培苗内生菌污染的方法，包括以下步骤：从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球（包含至少一个芽点），在自来水下冲洗30分钟，后用吸水纸吸干外植体表面水分，置于无菌培养瓶中用浓度为75%的乙醇针对灭菌60秒，再用体积分数为8%次氯酸钠溶液反复震荡消毒20分钟，后用无菌水冲洗3次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于27℃培养室中培养；培养23天时，分离新幼芽无菌转接到增殖培养基中继续培养；当组培苗根部出现细菌污染（表现为新生组培苗根部总是出现细菌污染）时，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培养基培养7天，连续转接3次直至生根。
实施例5
生根培养基：1/2 MS+0.15 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA，含20%蔗糖，1.0%琼脂，0.15‰易培隆，pH值为5.9。
增殖培养基：MS+3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，含30%蔗糖，0.9%琼脂，pH值为6.0，其中NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基腺嘌呤。
所述MS培养基，以1L计，组成为：NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。
一种抑制青花菜组培苗内生菌污染的方法，包括以下步骤：取青花菜种子（颗粒饱满、无病虫害），在自来水下冲洗60分钟，后用吸水纸吸干外植体表面水分，置于无菌培养瓶中用浓度为75%的乙醇针对灭菌30秒，再用体积分数为0.1%氯化汞反复震荡消毒15分钟，后用无菌水冲洗4次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25℃培养室中培养；培养20天时，分离新幼芽无菌转接到增殖培养基中继续培养；当组培苗根部出现细菌污染（表现为新生组培苗根部总是出现细菌污染）时，立即去掉受污染根部，接入到上述生根培养基培养10天，连续转接5次直至生根。