一种尾边桉生根培养基及应用的制作方法

本发明属于林业生物技术育种领域，特别涉及一种尾边桉生根培养基及应用。

背景技术：

边沁桉(Eucalyptus benthamii)为桉属(Eucalyptus)双蒴盖亚属(Symphomyrtus)高大乔木，天然分布仅限于悉尼西南部沿纳平河长100km、宽40km的地区。边沁桉在我国引种试验中表现出强适应性，具有速生、耐寒、抗高温等优良特性，是一个较适合中亚热带地区推广的优良桉属树种。

本发明所用的尾边桉(E.urophylla×E.benthamii)是母本为尾叶桉和父本为边沁桉的人工杂交种，适宜在华南北缘冷凉区和南亚热带的低山和丘陵地区栽培，适应粤北、桂北、赣南和湘南等区域气候，耐寒性强，且耐干旱和瘠薄，是一种具有开发潜力的人工商品林用栽植良种，已获得国家林业局颁发的新品种证书。

通过选育获得的良种，在种子生产过程中容易因杂交而使后代性状产生明显分离，优良性状在后代群体中难以稳定的保持。因此，需要采用组织培养等无性繁殖的方法，在其种苗生产时，使其优良性状得以稳定的保持。

在边沁桉组培快繁体系建立过程中，其不定根诱导具有较大难度，很难建立起可商业化应用的组培快繁技术体系(商业化的组培快繁技术体系需要生根率和移栽成活率在75％以上)。饶红欣等(2008年)通过腋芽或顶芽直接萌发建立了边沁桉无性快繁体系，虽然使得边沁桉生根诱导率达93.3％，但是移栽成活率只有70％左右，且使用其提供的生根培养基配方诱导本发明所用的尾边桉植物材料，其生根诱导率在20％以下，远不能达到工厂化育苗的要求。另外，饶红欣等(2011年)研究影响边沁桉组培苗生长的因素，发现BA的浓度对组培苗的增殖系数有极显著影响，对苗高生长无显著影响；IBA的浓度对生根率和生根数均有极显著影响；蔗糖的浓度对增殖系数和苗高生长均有极显著影响；光照对增殖系数有显著影响，对苗高无显著影响。经检索发现，对难生根桉树(含边沁桉)生根困难的原因和相关机理的探究尚未系统展开，只有一些零星的研究报道。如刘卫东(1998年)等人发现桉树生根被抑制与其含有的酚类和单宁类物质有关，且这2类物质浓度越高，生根抑制作用越强烈。总之，国内外现在对边沁桉的不定根诱导技术和相关机理的研究，在不定根诱导技术方面进行的研究较多，但进展不大，尚无有文献记载的已应用于工厂化生产的边沁桉生根培养基配方问世，国内种苗市场上也未见有边沁桉组培苗的规模化上市，更未见有边沁桉的组培无性系试验林出现。而不定根诱导技术的未能掌握，严重制约了该良种的推广和使用。

3-AB(3-aminobenzamide，3-氨基苯甲酰胺)是PARP(poly ADP-ribose polymerase，聚ADP核糖聚合酶)的一种有效抑制剂。在本发明中，3-AB作为一种生理活性物质，起到了诱导桉树不定根发生的显著效果，可以推测，3-AB在尾边桉的不定根诱导过程中，并非传统认知上的细胞抑制剂的作用，而是作为一种植物生长调节剂，行使了基因表达诱导和信号传导的功能。其功能和传统的生根诱导物质IBA一样，都是起到了诱导不定根产生的效果，但其诱导效果却优于IBA，因此，具有推广价值。查阅相关文献发现，该物质尚无应用在生根培养基配方中的先例。

本发明是发明人在利用切片技术观察尾边桉生根过程和内源激素检测的实验基础上，通过引入新型的生根诱导物质，获得了较好的生根效果，现在已经利用该生根培养基配方实现了边沁桉组培苗的规模化生产，在广东西江林业局和韶关龙山林场营造了边沁桉的组培无性系试验林。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可实现稳定诱导尾边桉生根的培养基。

本发明另一目的在于提供上述尾边桉生根培养基在诱导尾边桉生根中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种尾边桉生根培养基，其配方为：

①大量元素：硝酸铵530mg/L，硝酸钾500mg/L，七水硫酸镁300mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，二水氯化钙66mg/L，四水硝酸钙300mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖20g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的诱导生根物质：IBA0.5mg/L，ABT-1 1.5mg/L，3-AB 0.1mg/L。

上述的尾边桉生根培养基是在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶，终浓度为7.5g/L；2)添加了四水硝酸钙、泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、IBA、ABT-1和3-AB，各物质终浓度依次分别为：300mg/L、0.8mg/L、5mg/L、0.24mg/L、10mg/L、0.5mg/L、1.5mg/L和0.1mg/L；3)在原MS培养基配方的基础上浓度发生改变的物质有：硝酸铵，终浓度改变为530mg/L；硝酸钾，终浓度改变为500mg/L；七水硫酸镁，终浓度改变为300mg/L；磷酸二氢钾，终浓度改变为400mg/L；二水氯化钙，终浓度改变为66mg/L；盐酸吡哆醇，终浓度改变为0.25mg/L；盐酸硫胺素，终浓度改变为0.25mg/L；甘氨酸，终浓度改变为0.48mg/L；烟酸，终浓度改变为2mg/L；蔗糖，终浓度改变为20g/L。

所述的尾边桉生根培养基的pH值为5.8～6.0。

上述的尾边桉生根培养基在诱导尾边桉生根中的应用，具体包括以下步骤：将增殖培养后的尾边桉组培苗进行诱导生根培养，然后进行组培苗上袋，最后用于移栽大田和造林。

所述的生根培养的条件为：培养温度为22～25℃，每天光照时间为15～16h，黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，生根培养时间为20～30天。

优选的，所述的生根培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

所述的增殖培养的增殖培养基的配方为：

①大量元素：硝酸铵1800mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾270mg/L；

②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；

③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；

④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；

⑤蔗糖30g/L，卡拉胶7.5g/L；

⑥添加的植物生长调节剂：6-BA0.4mg/L，KT 0.5mg/L，IBA0.2mg/L。

上述的增殖培养基是在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶，终浓度为7.5g/L；2)添加了泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、6-BA、KT和IBA，各物质终浓度依次分别为：0.8mg/L、5mg/L、0.24mg/L、10mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L和0.2mg/L；3)在原MS培养基配方的基础上浓度发生改变的物质有：硝酸铵，终浓度改变为1800mg/L；磷酸二氢钾，终浓度改变为270mg/L；盐酸吡哆醇，终浓度改变为0.25mg/L；盐酸硫胺素，终浓度改变为0.25mg/L；甘氨酸，终浓度改变为0.48mg/L；烟酸，终浓度改变为2mg/L。

所述的增殖培养的增殖培养基的pH值为5.8～6.0。

所述的增殖培养的条件为：培养温度22～25℃，每天光照时间为15～16h，黑暗时间为8～9h，光照强度为1500～2000lx，每隔30～40天继代培养一次。

优选的，所述的增殖培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，每隔35天继代培养一次。

上述的尾边桉增殖培养基配方中6-BA是常用的细胞分裂素，已知可以促进细胞分裂，促进组织分化，并可促进侧芽发生；KT是一种非天然的细胞分裂素，可以促进细胞分化、分裂、生长，还可促进芽分化；这2种物质同IBA联用，可使桉树保持均衡的分裂(增殖)和生长状态。

本发明的机理为：

本发明在切片观察尾边桉生根过程和检测内源激素变化规律基础上，通过引入新型的生根诱导物质，获得了较好的生根诱导效果。本发明的尾边桉生根培养基在原MS培养基配方的基础上做如下改变：1)琼脂替换为卡拉胶；2)添加了四水硝酸钙、泛酸钙、半胱氨酸、生物素、苯甲酸钠、IBA、ABT-1和3-AB；3)在原MS培养基配方的基础上改变了硝酸铵、硝酸钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、烟酸和蔗糖的终浓度。其中，卡拉胶是培养基的凝固剂，用于固体培养；IBA是诱导生根的传统激素，它在促进细胞分化和分裂，不定根形成和维管束系统的分化方面具有确定性的作用；ABT-1是中国林业科学研究院王涛院士研发成功的商品化应用的生根粉，它可以强化、调控植物内源激素含量及酶的活性，促使大分子合成，诱导不定根形态建成；3-AB是传统意义上的细胞抑制剂，其在不定根诱导等新功能上的研究刚刚开始。在其它2种生根诱导物质的配合下，3-AB起到了诱导不定根产生的显著效果，使形成层细胞的生长和发育方向发生了改变，由薄壁细胞状态发育成为不定根的根原基形态，细胞变小和变密，并不断沿平周方向进行分裂，最终突破表皮生长成为侧根。3-AB，IBA和ABT-1这3种物质一起使用的效果显著优于单独使用IBA或ABT-1所产生的生根诱导效果。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

(1)本发明通过添加新型的生根诱导物质3-AB，并在其他生根类生长调节剂的协同作用下，使得尾边桉的生根率在85％以上，移栽成活率在90％以上，生根苗上袋后生长整齐且健壮，抗性强，完全达到了规模化和商品化生产种苗的要求。

(2)本发明的生根培养基在应用时重复性好，效果稳定，多次使用后发现，在生根率和移栽成活率上无较大波动，因此，是彻底解决了尾边桉组培诱导的难生根问题。采用本发明所用生根培养基，已实现尾边桉组培生根苗的规模化和工厂化生产。

附图说明

图1为经过增殖培养后的尾边桉增殖苗。

图2为实施例1中经过生根培养后的尾边桉生根苗。

图3为实施例1中组培生根苗移栽后成活的尾边桉种苗。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。本发明实施例中所用ABT-1购自北京艾比蒂生物科技有限公司，3-AB(PARP抑制剂)购自美国Sigma公司。

在本发明的实施例中，所有实施例中采用的生根培养基均包含改良的MS培养基：①大量元素：硝酸铵530mg/L，硝酸钾500mg/L，七水硫酸镁300mg/L，磷酸二氢钾400mg/L，二水氯化钙66mg/L，四水硝酸钙300mg/L；②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；⑤蔗糖20g/L，卡拉胶7.5g/L。

所有实施例中增殖培养的增殖培养基的配方为：①大量元素：硝酸铵1800mg/L，硝酸钾1900mg/L，二水氯化钙440mg/L，七水硫酸镁370mg/L，磷酸二氢钾270mg/L；②微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，六水氯化钴0.025mg/L；③铁盐：七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L；④有机成分：盐酸吡哆醇0.25mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，甘氨酸0.48mg/L，泛酸钙0.8mg/L，烟酸2mg/L，肌醇100mg/L，生物素0.24mg/L，苯甲酸钠10mg/L，半胱氨酸5mg/L；⑤蔗糖30g/L，卡拉胶7.5g/L；⑥添加的植物生长调节剂：6-BA 0.4mg/L，KT 0.5mg/L，IBA 0.2mg/L。增殖培养基的pH值为5.8，增殖培养的条件为：培养温度为23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，每隔35天继代培养一次。

实施例中所用的尾边桉已申请植物新品种，新品种名称为尾边桉TH06001(E.urophylla×E.benthamii TH06001)，该植物品种权号为20130085，本发明的申请人属新品种品种权人，拥有用于本发明所需的植物材料。

对比实施例1：

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗(如图1所示)，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240ml玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+ABT-1 1.5mg/L(终浓度)+3-AB 0.1mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为培养温度23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

对比实施例2：

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240mL玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+IBA0.5mg/L(终浓度)+3-AB 0.1mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为培养温度23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。

实施例1

取在无菌组培瓶内生长高度超过2.5cm的组培增殖苗，在超净工作台上切去基部的愈伤组织，转接到无菌的已加入生根培养基的组培瓶内。组培瓶为240mL玻璃组培瓶，加入的生根培养基体积为30mL。生根培养基的配方包括：改良MS+IBA0.5mg/L(终浓度)+ABT-1 1.5mg/L(终浓度)+3-AB 0.1mg/L(终浓度)，且pH为5.8。培养的条件为培养温度23℃，每天光照时间为16h，黑暗时间为8h，光照强度为1800lx，生根培养25天。生根培养后的尾边桉生根苗如图2所示。

实施例1和对比实施例1～2的生根结果如表1所示，取样均取100株，各指标计算公式如下：

生根率(％)＝生根株数/接种总株数×100％

平均根数(条)＝总生根数/生根株数

平均根长(cm)＝所有根总长/总生根数

平均株高(cm)＝所有苗总高/总株数

表1尾边桉生根诱导结果

从表1可以看出，3-AB作为传统意义上的细胞抑制剂，在其它2种生根诱导物质(IBA和ABT-1)的配合下，3-AB起到了诱导不定根产生的显著效果，通过使用本发明所述生根培养基可使尾边桉的生根率达到85％以上。移栽后，成活率可达90％以上，移栽后成活的尾边桉种苗如图3所示。说明该生根培养基可建立起商业化组培快繁技术体系。

取1000株上袋生根苗进行病害调查，病害发生率为2％，说明种苗抗性强，不易生病；移袋45天后取1000株小苗测定株高，平均株高为7.1cm，最大值为7.8cm，最小值为6.5cm，最大值-最小值＝1.3cm，最大和最小值离平均值偏移值分别为0.7cm和0.6cm；另取5000株上袋生根苗，分5次用本发明的生根培养基进行培养并测试生根的生根率，每次取1000株，5次结果分别为90.0％，82.6％，83.1％，86.2％，84.5％。最大和最小生根率差距在7.4％，最终生根率平均值为85.3％，最大和最小生根率与平均值偏移程度分别为4.7％和2.7％。说明本发明的生根培养基在应用时重复性好，效果稳定，多次使用后发现，在生根率和移栽成活率上无较大波动，且生根苗上袋后生长整齐且健壮，抗性强，完全达到了规模化和商品化生产种苗的要求。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。