一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥及其制备方法与流程

文档序号:12515136阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该微生物菌肥的原料配比为:阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土壤短芽孢杆菌菌粉10-30份,克劳氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份,黄腐酸钾10-30份。

2.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,其制备方法,包括以下步骤:

步骤一、阿布拉链霉菌菌粉的制备

取出阿布拉链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为阿布拉链霉菌种子液;

二级种子扩培:将上述制备的阿布拉链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的阿布拉链霉菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:0.8,28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到80g/L时,即可作为阿布拉链霉菌二级种子液;

发酵:将上述制备的阿布拉链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的阿布拉链霉菌固体发酵培养基上,菌种与阿布拉链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的阿布拉链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于30亿CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到阿布拉链霉菌菌粉;

其中,所述的高氏一号固体培养基:硝酸钾:1克,可溶性淀粉:20克,磷酸氢二钾:0﹒5克,硫酸镁:0﹒5克,氯化钠:0﹒5克,硫酸亚铁:0﹒01克,琼脂:20克,蒸馏水补足1000ml,PH7﹒2~7﹒4;

其中,所述的阿布拉链霉菌二级液体种子培养基:菜粕粉2%,木薯粉2%,氯化钠0.2%,碳酸钙1%,硫酸镁0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

其中,所述的阿布拉链霉菌固体发酵培养基:粗玉米皮80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,麸皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤二、田无链霉菌菌粉的制备

取出田无链霉菌菌种保藏管,用高氏一号固体培养基划平板进行复苏,30℃培养7天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养6-8天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为田无链霉菌种子液;

二级种子扩培:将上述制备的田无链霉菌种子液以1%的接种量接种至灭菌的田无链霉菌液体二级种子培养基上,500L的发酵罐装液量为350L,通气量为每分钟液气比为1:0.8,28-30℃培养36-48小时,待菌体含量达到60g/L时,即可作为田无链霉菌二级种子液;

发酵:将上述制备的田无链霉菌二级种子液以20%的接种量接种至灭菌的田无链霉菌固体发酵培养基上,菌种与田无链霉菌固体培养基混合均匀后,将接好种的田无链霉菌固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,前两天空气湿度保持为60%-75%,过后空气湿度保持为40%-50%,发酵3-5天,检测其孢子含量不低于50亿CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到田无链霉菌菌粉;

其中,所述的高氏一号固体培养基与步骤一中的高氏一号固体培养基相同;

其中,所述的田无链霉菌二级液体种子培养基:棉粕粉2%,玉米粉2%,氯化钠0.2%,碳酸钙1%,硫酸镁0.1%,磷酸氢二钾0.1%,PH7﹒2~7﹒4;

其中,所述的田无链霉菌固体发酵培养基:甘蔗渣80%,菜粕2%,木薯粉1%,石粉9%,粗玉米皮8%,硫酸锰0.004%,磷酸氢二钾0.1%,硫酸镁0.05%,固体培养基含水量为40%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤三、土壤短芽孢杆菌菌粉的制备

取出土壤短芽孢杆菌保藏管,用无氮固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养72小时,在平板下挑取单个菌落接种至装有无氮固体培养基,在30℃培养箱中培养72小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L土壤短芽孢杆菌种子培养基的500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前8小时通气量为100L/min,8-24小时后通气量为200L/min ,24小时后通气量为300L/min ,30℃培养32-48小时,待总菌数含量不低于20亿cfu/ml,即可作为土壤短芽孢杆菌种子液;

发酵:将上述制备的土壤短芽孢杆菌种子液以10%-20%的比例接种至土壤短芽孢杆菌固体培养基上,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于50亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到土壤短芽孢杆菌菌粉;

其中,所述无氮固体培养基:蔗糖10g,磷酸氢二钾0.2g,硫酸镁0.2g,氯化钠0.2g,硫酸钙0.1g,碳酸钙5g,琼脂18g,蒸馏水1000mL,pH7.2;

其中,所述土壤短芽孢杆菌种子培养基:糖蜜20g/L,玉米淀粉10 g/L, 棉粕粉40 g/L,硫酸镁0.4 g/L,硫酸锰0.6g/L,磷酸二氢钾0.6 g/L,碳酸钙10 g/L, pH7.0,各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

其中,所述的土壤短芽孢杆菌固体培养基:甘蔗渣57%,麸皮35%,棉粕5%,石粉1%,粗玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤四、克劳氏芽孢杆菌菌粉的制备

取出克劳氏芽孢杆菌保藏管,用营养肉汁固体培养基分别划平板进行复苏,30℃培养48小时,在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汁固体培养基,在30℃培养箱中培养48小时,用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱,接种至装有300L液体种子培养基的500L发酵罐中,开搅拌120r/min,前10小时通气量为200L/min,10小时后通气量为320L/min ,30℃培养16-24小时,待总菌含量不低于20亿cfu/ml,即可作为克劳氏芽孢杆菌种子液;

发酵:将上述制备的克劳氏芽孢杆菌种子液以总接种量的10%-20%的接种量加至克劳氏芽孢杆菌固体发酵培养基中,混匀,在浅盘上发酵,堆料厚度为5-10cm,控制发酵温度为30-40℃,发酵36-48小时,待芽孢含量不低于80亿cfu/g,即可晒干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到克劳氏芽孢杆菌菌粉;

其中,所述营养肉汤固体培养基:蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L,氯化钠5.0 g/L,琼脂20 g/L ,pH 7.2 ± 0.2;

其中,所述液体种子培养基:糖蜜35 g/L, 豆粕粉20 g/L,硫酸镁0.6g/L,硫酸锰0.5 g/L,磷酸二氢钾0.3 g/L,碳酸钙5.0 g/L,pH7.0;

其中,所述的克劳氏芽孢杆菌固体发酵培养基:麸皮50%,粗玉米皮 42%,棉粕5%,石粉1%,啤酒糟2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤五、桔绿木霉菌粉的制备

桔绿木霉种子液的制备:取出桔绿木霉菌种保藏管,用PDA固体培养基划平板进行复苏,30℃培养6天,在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中,在培养箱中30℃培养4-6天,待菌苔长满茄子瓶,产生大量孢子即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱,调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml,即为桔绿木霉种子液;

发酵:将上述制备的桔绿木霉种子液以2%的接种量接种至灭菌的桔绿木霉固体发酵培养基上,菌种与桔绿木霉固体培养基混合均匀后,将接好种的桔绿木霉固体发酵培养基摊在发酵槽上,物料高度为5-10cm,控温28-32℃,湿度保持为60%-75%,发酵4-6天,检测其总孢子含量不低于30亿CFU/g,即可低温风干,待水分含量低于10%,粉碎过100目筛,即得到桔绿木霉菌粉;

其中,所述的PDA固体培养基:土豆200g,蔗糖20g,水1000mL,琼脂20g;

其中,所述的桔绿木霉固体发酵培养基:甘蔗渣85%,芝麻渣粕2%,玉米芯5%,石粉4%,粗玉米皮2%,尿素0.4%,磷酸氢二钾0.4%,硫酸镁0.05%,培养基含水量50%-60%;各培养基灭菌的条件为:0.10-0.15MPa,121℃灭菌30分钟;

步骤六、将上述步骤中的阿布拉链霉菌菌粉10-30份,田无链霉菌菌粉10-30份,土壤短芽孢杆菌菌粉10-30份,克劳氏芽孢杆菌菌粉10-30份,桔绿木霉菌粉10-30份与黄腐酸钾10-30份混匀,包装即为复合微生物菌肥。

3.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为拌种,拌种的用量为每千克种子用50-150克复合微生物菌肥均匀拌种。

4.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为浇根,浇根的使用方法为:将复合微生物菌粉稀释100-200倍,每棵棉花浇根复合微生物菌粉稀释液50-100毫升。

5.根据权利要求1所述的一种防治棉花黄萎病的复合微生物菌肥,其特征在于,该复合微生物菌肥在防治黄萎病的方法为底施:在翻地之前均匀施入本复合微生物菌肥5-10kg。

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