本发明涉及林果树领域，尤其是一种嘉宝果组织培养体系的建立方法。
背景技术：
嘉宝果的特有性状终年常绿，生长缓慢，树形优美，又不会寄生介壳虫、蚜虫。果实既可食用，亦可供人观赏，应用在阳台盆植、庭园景观或盆栽玩赏都极为合适。果实可鲜食，亦可加工为水果酒、果汁、冰淇淋及糕饼馅料等。惟鲜果容易失水，存放于一般室温下2-3天即会发酵，不耐贮放，大大限制了其鲜果市场的拓展，因此虽然嘉宝果果皮坚硬，但在采收过程中应注意避免碰撞及造成伤口，以免果实损伤、失水或感染病菌而加速腐烂。国外研究出于果表涂布果腊或包塑料膜置于低温环境下，可延长嘉宝果果实的贮藏寿命，本场初步的试验结果为将采后的果实散除田间热后，尽速放入聚乙烯塑料袋内，于低温下可减少失水及发酵作用，延长贮藏寿命为2周，显示改进包装材料与适当的贮藏温度可有效延长嘉宝果的鲜果寿命，若能将此采后处理法纳入生产体系中，相信嘉宝果应能更加普及于台湾的水果市场中。嘉宝果每百克果实可食用部分含热量45.7Ka。水87.1g，蛋白质0.1lg，脂肪0.01g，碳水化合物12.58g，纤维0.08g，灰分0.20g，钙6.3mg，磷9.2mg，铁0.49rag，硫胺素0.2mg，维生素Bz 0.02rag，烟酸0.21rrg，维生素C22.7mg，色氨酸lmg，赖氨酸7mg。高营养成份、珍贵、稀有、其果肉透明、柔软多汁、风味特殊、气味芬芳、果肉富含水分、维他命C、高钙、磷、铁、纤维、碳水化合物、维他命B1、卡路里、核黄素、色氨基酸、灰分、脂肪、蛋白质等15种以上之高营养成份。新鲜水果除了可以生吃以外，还可以做成果冻、蜜饯、果酱以及风味极佳嘉宝果酒——经常食用有利于预防心血管疾病，增强抵抗力，尤其对女性的活力年轻、皮肤亮丽有着显著促进作用。成熟果其果肉呈多汁半透明，全熟时甘甜无比，口味特殊。成熟果其果肉透明、柔软多汁，风味特殊、气味芬芳，甜度平均可达13至18度，香甜可口，口感独特，味似山竹、香芭乐、释迦、凤梨等多种风味，食用入口后口感将经历4种不同之独特口味。阳光：嘉宝果为常绿果树，性喜温暖，耐高温。温度：秋至春季为生长盛期,最适温度22℃~35℃。土壤：嘉宝果适合栽培在偏酸性土壤中成长最好。施肥：可用水溶性肥料或长效性肥料。修枝：盆栽视造形需求每修分；一般则不需要。水份：植地植株宜在地表周围加高土提，以利灌水灌溉。繁殖方法，播种或扞插。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种嘉宝果组织培养方法，本发明以嘉宝果茎尖为外植体，经过外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等过程有效地提高了芽的诱导率、继代系数及生根率，进而建立了完整的嘉宝果组织培养体系，从而实现了本发明的目的。具有工艺方法简单易行，可操作性强，诱导率提高，生根多果特点。
本发明的技术解决方案是这样的，一种嘉宝果组织培养体系建立的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1，外植体消毒：取健壮嘉宝果当年生的茎尖，刷洗干净后，用洗衣粉溶液浸泡12min后用毛刷刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗5h后超净工作台中，先用75%乙醇消毒32s后用无菌水洗8次，再用0.1%升汞溶液消毒28min，用无菌水冲洗8次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用;
步骤2，启动培养：将经步骤（1）处理后的茎尖接种到启动培养基进行芽诱导，接种后先在30℃条件下全暗培养9天后统计污染率和存活率，然后每天光照15小时，光照强度为3200lx条件下培养32天，统计组培苗的萌动率及生长情况;
步骤3，增殖培养：将步骤（2）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的丛生芽切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照15小时，光照强度为3000lx，培养温度为29℃的条件下培养32天后观察生长情况和芽增殖情况，多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽;
步骤4，壮苗培养：将经步骤（3）增殖培养的丛生苗切成适当大小，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，以利于生根，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照15小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养至组培苗生长到4cm以上;
步骤5，生根培养：将步骤（2）、（3）或（4）过程获得的高度4.0cm以上的组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在29℃条件下全暗培养5天，然后每天光照16小时，光照强度为3200lx，培养温度为29℃的条件下培养1个月后统计生根情况;
步骤6，炼苗移栽：将步骤（5）获得的高约9cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖自然光照下炼苗9天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝4:1混合成的基质,光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度 ,待幼苗成活后再移栽大田。
步骤（2）所述的启动培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.7mg/L NAA+32g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.9。
步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.2mg/LNAA+7mg/L 6-BA+32g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH为5.9。
步骤（4）所述的壮苗培养基为：MS+0.8mg/L 6-BA+1.2mg/L GA3+32g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH为5.9。
步骤（5）所述的生根培养基为：1/2MS+6.5mg/L IBA+32g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH为5.9。
本发明的优点是：通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量嘉宝果优良品种试管苗的方法。本发明以嘉宝果茎尖为外植体，经过外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等过程有效地提高了芽的诱导率、继代系数及生根率，进而建立了完整的嘉宝果组织培养体系，以便进行嘉宝果种苗工厂化生产。果子可做成果冻、果酱、果酒，有保健作用，预防心血管病，增加抵抗力，护肤亮肤。
具体实施方式
下面实施例是对本发明的进一步说明。
实施例1
（一）种子繁殖：此为嘉宝果目前最主要的繁殖方法，每果有种子1至4粒，呈不规则棱型，为多胚性。新鲜种子发芽较佳，一般将果皮压破后挤出种子，待1-2日后果肉酸化腐烂，再以清水洗除果肉，即可播种。果实采收后贮藏于塑料袋，于5-8℃下冷藏，欲播种时再取出种子洗净后播种，冷藏可维持1-2个月，仍有一定的发芽率。种子于播种20-40天后发芽，气温低时发芽较慢。
（二）嫁接法：多数嘉宝果品种的实生苗木需6-10年方能开始结果，利用嫁接法可提早结果，嫁接后约3年可结果，选用二年生苗木作为砧木，由结果母树剪取一年生枝条为接穗，于秋冬季切接或靠接成活率较高，3-4月以后接活率较差，夏季嫁接不易成功。
（三）扦插法：嘉宝果不易扦插存活，国内研究其为一典型难发根物种，可于每年五月份以半硬枝插（2节4片叶），速浸NAA 2000 ppm，以泥炭土为生根介质，发根率可达九成。而国外研究则是以10公分长插穗，带3-4对成熟叶，于砂混合泥炭土（比例1：1）的介质中扦插为佳，插穗基部纵切4条加IBA 1000 ppm处理可促进发根。（四）修剪：因嘉宝果生育缓慢，平时无须强剪，但为控制株高及盆栽树型，宜适时修剪顶端生长旺盛的枝条，通常栽培上建议修剪低处及内部细短枝条，以塑造通风且枝干优美之树型，另秋冬季可修剪密生或徒长枝条。
（四）苗期管理：一是抹芽定梢，萌芽后抹去双芽、多头芽、过弱芽。形成新梢后,往两边铁丝引缚,按15～20cm间距定梢并及时喷施促花王3号，可有效控梢狂长，促多抽花枝，促花芽分化。可有效均衡大小花穗，省去疏花疏果之烦。要根据生长阶段适时追肥，即花果肥、果膨肥、着色肥以及采后催生肥。特别要注意做到NPK等各种肥素的合理匹配，确保营养的均衡供给。
（五）病虫害管理：嘉宝果为浅根性、灌丛果树，此树种对病虫害抗力强，病虫害少，管理上甚少使用农药，是极为好栽植照顾之树种。嘉宝果在国内栽培发生的病虫害少，管理上甚少使用农药，是极为好栽植照顾之树种。惟在结果期间容易受鸟害，可在植株外围覆盖黑网或搭设网室防止鸟食，亦可用双层报纸套袋以保护果实。若有毒蛾类幼虫危害叶片，可施用植物保护手册推荐用药防治。在国外，湿热季节容易发生锈病，可藉由修剪提高植株内部光线及改善通风来预防，发生时可喷施杀菌剂以降低病原密度。另外蚜虫、果实蝇、介壳虫及甲虫类国外都有发生的纪录，国内栽培时应一并注意这些病虫害。
实施例2
（1）外植体消毒：取健壮嘉宝果当年生的茎尖，刷洗干净后，用洗衣粉溶液浸泡6min后用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒6s后用无菌水洗4次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗5次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）启动培养：将经步骤（1）处理后的茎尖接种到启动培养基进行芽诱导，接种后先在26℃条件下全暗培养5天后污染率低至3%，存活率达78%。然后每天光照12小时，光照强度为1600x条件下培养32天，组培苗的萌动率为70%。所述的启动培养基为：MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.9。
（3）增殖培养：将步骤（2）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的丛生芽切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后每天光照10小时，光照强度为1000lx，培养温度为28℃的条件下培养30天后芽增殖系数为4.89。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽。所述的增殖培养基为：MS+0.5mg/LNAA+3mg/L 6-BA+15g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8。
（4）壮苗培养：将经步骤（3）增殖培养的丛生苗切成适当大小，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，以利于生根。接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养15天组培苗即可生长到2cm以上。所述的壮苗培养基为：MS+0.3mg/L 6-BA+0.05/L GA3+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（5）生根培养：将步骤（2）、（3）或（4）过程获得的高度2.0cm以上的组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养1个月后生根率达93.5%。所述的生根培养基为：1/2MS+2mg/L IBA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（6）炼苗移栽：将步骤（5）获得的高约5.5cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为96%以上。
实施例3：
（1）外植体消毒：取健壮嘉宝果当年生的茎尖，刷洗干净后，用洗衣粉溶液浸泡8min后用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗3h后超净工作台中，先用75%乙醇消毒12s后用无菌水洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒14min，用无菌水冲洗6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
（2）启动培养：将经步骤（1）处理后的茎尖接种到启动培养基进行芽诱导，接种后先在28℃条件下全暗培养4天后污染率低至5%，存活率达81.6%。然后每天光照13小时，光照强度为1400x条件下培养29天，组培苗的萌动率为79%。所述的启动培养基为：MS+0.8mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.7。
（3）增殖培养：将步骤（2）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的丛生芽切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后每天光照10小时，光照强度为1500lx，培养温度为28℃的条件下培养30天后芽增殖系数5.13。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽。所述的增殖培养基为：MS+0.3mg/LNAA+5mg/L 6-BA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.8。
（4）壮苗培养：将经步骤（3）增殖培养的丛生苗切成适当大小，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，以利于生根。接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后每天光照11小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养17天组培苗即可生长到3cm以上。所述的壮苗培养基为：MS+0.4mg/L 6-BA+0.1/L GA3+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（5）生根培养：将步骤（2）、（3）或（4）过程获得的高度2cm以上的组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在26℃条件下全暗培养1天，然后每天光照10小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养29天后生根率达96%。所述的生根培养基为：1/2MS+4mg/L IBA+18g/L蔗糖+3.7g/L琼脂，pH为5.8。
（6）炼苗移栽：将步骤（5）获得的高约2cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为93%以上。