一种植物生根壮苗培养基及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种植物生根壮苗培养基及其制备方法和应用，属于植物组织培养和转基因技术领域。

背景技术：

植物组织培养技术是20世纪初发展起来的技术，是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、原生质体等在合适的条件进行离体培养，诱导产生愈伤组织、不定芽等，之后形成完整植株的过程。组织培养技术因其具有可以利用各种人工培养条件控制细胞的生长、分化等优点，有力地推动了植物生理学、病理学、药学、遗传学、育种以及生物化学等学科的交叉发展，并广泛应用于农业、林业、园艺、工业、医药业等多种行业，产生巨大的经济效益和社会效益，归纳起来，有以下几个方面：1、苗木的离体快繁；2、培育脱毒苗；3、应用于植物育种如单倍体育种、原生质体融合、胚和胚乳的培养基转基因育种等；4、生产次生代谢产物如中药成分等；5、人工种子和种质保存；6、基因功能研究等。

在合适的离体培养条件下，原来已经组织特异化的细胞，重新分裂形成具备全能性的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化”；经“脱分化”的全能细胞，重新形成根、芽以及输导系统等各种类型细胞的过程称为“再分化”。脱分化和分化是植物组织培养的重要环节，对组织培养效率起着决定性影响。除此之外，组织培养和基因转化所获得的试管苗往往长势较弱，根系不发达，移栽后成活率低，严重影响试管苗的培养效率和进一步的应用效果。因此，建立一种高效的植物生根壮苗系统，就显得尤为重要。

烯效唑(Uniconazole)是一种植物生长调节剂，是内源赤霉素合成的抑制剂，具有延缓植物生长，抑制茎杆伸长，缩短节间；减弱稻苗顶端生长优势，促进侧芽(分蘖)滋生，促进花芽分化；增加植物抗逆性能，提高产量等效果。烯效唑用量小、活性强，较低浓度就有良好的作用，能被种子、叶、根部吸收，喷施后，秧苗外观表现矮壮多蘖，叶色浓绿，根系发达，但不会使植株畸形，持效期长，对人畜安全。且其在土壤中的残留量仅为烯效唑的1/10，因此对后茬作物影响小，适用于水稻、小麦、玉米、花生、大豆、棉花、果树、花卉等作物等增加分蘖，控制株高，提高抗倒伏能力。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种植物生根壮苗培养基。本发明通过探索不同的添加物对植物试管苗的作用，筛选出一种生根壮苗培养基，使植物幼苗和对照比，不仅幼苗变矮壮且叶色深绿，生根快、变粗且根毛增多变长，移栽后，幼苗返青快，长势好，从而提高植物试管苗的移栽存活率，最终提高研究基因功能和组培育种的效率。

本发明提供的植物生根壮苗培养基，其为含有烯效唑的生根培养基。

所述生根培养基包括但不限于MS培养基、N6培养基或B5培养基等，在本发明的一个实施例中，采用的生根培养基为1/2MS培养基。本发明的生根培养基包括但不限于1/2MS培养基。本发明实施例中所述1/2MS基础培养基为本领域通用术语，可市售获得，也可自行配制，其配方为公知常识。

本发明的植物生根壮苗培养基中，烯效唑的浓度为0.05-1mg/L。

优选地，烯效唑的终浓度为0.1-0.5mg/L。

更优选地，烯效唑的终浓度为0.1-0.2mg/L。

进一步地，本发明的植物生根壮苗培养基还含有糖分，所述糖分在所述植物生根壮苗培养基中的浓度为15-25g/L，优选20g/L。

本发明的植物生根壮苗培养基pH值为5.7-6.0。

本发明的植物生根壮苗培养基还含有凝固剂，优选的凝固剂为Phytagel植物凝胶或琼脂粉。Phytagel植物凝胶是从假单胞菌分泌而来的一种琼脂的替代物，又名Gelrite,Geuam Gum等。可从市售获得，例如SIGMA公司。

所述Phytagel植物凝胶在所述生根壮苗培养基中的浓度为3-4g/L。优选为3g/L。所述琼脂粉在所述生根壮苗培养基中的浓度为6-8g/L，优选为7.5g/L。

较佳地，上述生根壮苗培养基，是在1/2MS生根培养基中添加烯效唑、蔗糖和Phytagel植物凝胶而制得；其中，所述烯效唑、蔗糖和Phytagel植物凝胶在所述生根壮苗培养基中的浓度分别为0.1-0.2mg/L、20g/L、3g/L；所述生根壮苗培养基其pH值为5.7-6.0。

本发明提供了上述植物生根壮苗培养基在培育植物试管苗、组织培养或基因转化中的应用，所述植物为水稻、玉米、小麦、大麦、小米、高粱、花生、大豆、甘薯、马铃薯、棉花或油菜。

上述应用中，培养条件为温度28-35℃，光照培养，培养周期7-15d。

本发明提供了烯效唑在制备植物生根壮苗培养基中的应用，在生根培养基中添加烯效唑，烯效唑的终浓度为0.05-1mg/L，所述植物生根壮苗培养基能够使植物幼苗生根快，根变粗，根毛增多变长，移栽存活率高，移栽后，幼苗返青快，长势好。

所述生根培养基包括但不限于1/2MS培养基、1/2N6培养基或1/2B5培养基。

本发明还提供上述生根壮苗培养基在植物试管苗、组织培养及基因转化中的应用。

本发明还提供一种培养生根壮苗的方法，包括以下步骤：将经组织培养获得的幼苗置于提前准备好的上述生根壮苗培养基上培养；优选地，上述培养条件为温度28-35℃，光照培养，培养周期7-15d。

本发明的优点在于：

1、本发明在培养基内添加0.05-1mg/L的烯效唑，使试管苗变矮壮，叶色深绿，移栽后幼苗返青快，长势好，提高试管苗的移栽存活率。

2、本发明培养条件为28-35℃，光照培养，在该条件下诱导试管苗生根，生根快，根粗且根毛增多变长。

本发明通过摸索和实践，进一步优化植物生根壮苗培养基，最终摸索出一种高效的植物生根壮苗培养基。该生根培养基对水稻、玉米、小麦、大麦、花生、大豆、棉花等作物的试管苗、组织培养和基因功能研究等具有较强的实用价值。本发明所述的生根壮苗培养基具有使植物试管苗生根快，普通培养基用于生根培养时，长出新的根需要2d，而使用本发明培养基则只需1d，新根粗且根毛多而长(见图3)，苗矮壮、叶色深绿(见图4、5)以及移栽后返青快，移栽2d后就返青、长势好的优点(见图7)、长势好的优点，从而显著提高试管苗的移栽存活率，存活率可达到98％，最终提高研究基因功能和组培育种的效率。

附图说明

图1为水稻幼苗在不同培养基中生根壮苗培养15d后的根长、芽长及根数目的变化。添加烯效唑的培养基可抑制茎叶徒长。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L；、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图2为水稻种子在不同培养基中生根壮苗培养15d后的根长、芽长及根数目的变化。添加烯效唑的培养基可抑制茎叶徒长。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L；、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图3为水稻幼苗在不同培养基中生根壮苗培养15d后的幼根显微结构。幼苗在添加烯效唑的培养基中幼根粗壮且根毛极多且长。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L。

图4为水稻幼苗在不同培养基中生根壮苗培养15d后的生长状况。添加烯效唑的培养基中幼苗矮壮、叶片宽厚、叶色深绿。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图5为水稻种子在不同培养基中生根壮苗培养15d后的生长状况。添加烯效唑的培养基中幼苗矮壮、叶片宽厚、叶色深绿。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图6为水稻幼苗在含0.5mg/L IBA的培养基1/2MSIBA中生根壮苗培养15d后的生长状况。添加IBA的培养基中幼苗长势类似1/2MS，幼苗细长，幼根短且细。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；1/2MSIBA，生根培养基中添加0.5mg/L IBA。

图7为水稻幼苗在不同培养基中生根壮苗培养15d后，移栽7d、15d的生长状况。移栽7天时添加烯效唑培养基中的幼苗已经开始生长，但在1/2MS培养基中生长的幼苗仍处于返青期。移栽15天后，添加烯效唑培养基中的幼苗株高已超过1/2MS培养基中的。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图8为水稻幼苗在不同培养基中生根壮苗培养15d后，移栽后15d的株高。添加烯效唑的培养基中幼苗的株高都比对照高。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

图9为水稻种子在不同培养基中生根壮苗培养15d后，移栽后15d的株高。添加一定浓度烯效唑的培养基中幼苗的株高都比对照高。1/2MS，生根培养基中不添加任何激素；S0.05，S0.1，S0.2，S0.5，S1，分别为生根培养基中添加烯效唑0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

为配制方便，先配制以下母液，再由母液配制成各培养基。各母液由溶剂和溶质水组成，溶质具体配方如下：

实施例1

一种生根壮苗培养基(简写为MET0.05)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.05mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为6.0。

实施例2

一种生根壮苗培养基(简写为S0.08)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.08mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.7。

实施例3

一种生根壮苗培养基(简写为S0.1)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.1mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.8。

实施例4

一种生根壮苗培养基(简写为S0.12)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.12mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.9。

实施例5

一种生根壮苗培养基(简写为S0.15)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.15mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.8。

实施例6

一种生根壮苗培养基(简写为S0.18)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.18mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.8。

实施例7

一种生根壮苗培养基(简写为S0.22)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.22mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.9。

实施例8

一种生根壮苗培养基(简写为S0.25)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.25mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为6.0。

实施例9

一种生根壮苗培养基(简写为S0.28)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.28mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.7。

实施例10

一种生根壮苗培养基(简写为S0.3)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.3mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.9。

实施例11

一种生根壮苗培养基(简写为S0.4)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.4mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为6.0。

实施例12

一种生根壮苗培养基(简写为S0.5)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.5mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.8。

实施例13

一种生根壮苗培养基(简写为S1)，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为1mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为6.0。

实施例1-13所述生根壮苗培养基，其制备方法包括按配方将各组分添加到1/2MS基础培养基中即得。

实施例14

一种生根壮苗培养基，是在1/2MS基础培养基中添加烯效唑而制得；其中，所述烯效唑在所述生根壮苗培养基中的浓度为0.2mg/L；该生根壮苗培养基中还含有浓度为20g/L的蔗糖，浓度为3g/L的Phytagel植物凝胶，pH值为5.8。

实施例15

本实施例提供一种生根壮苗培养基的制备方法，其配方同实施例14。以配置1L该生根壮苗培养基为例，其制备方法包括：取1/2MS大量(10×)100ml，1/2MS微量(100×)10ml，有机(100×)10ml，铁盐(100×)10ml混合后加入20g蔗糖，添加烯效唑至所需浓度，完全溶解后调pH 5.8，得混合液。称取3g Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，分装至生根管中，116℃灭菌15min。

对比例1 不添加烯效唑

一种培养基1/2MS，以配置1L该生根壮苗培养基为例，其制备方法包括：取1/2MS大量(10×)100ml，1/2MS微量(100×)10ml，有机(100×)10ml，铁盐(100×)10ml混合后加入20g蔗糖，完全溶解后调pH 5.8，得混合液。称取3g Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，分装至生根管中，116℃灭菌15min。

对比例2 不添加烯效唑，添加IBA

一种培养基1/2MSIBA，以配置1L该生根壮苗培养基为例，其制备方法包括：取1/2MS大量(10×)100ml，1/2MS微量(100×)10ml，有机(100×)10ml，铁盐(100×)10ml混合后加入20g蔗糖，0.5mg/L的IBA；完全溶解后调pH 5.8，得混合液。称取3g Phytagel植物凝胶溶于800ml去离子水，置于微波炉中煮沸至完全溶解，加入上述混合液中定容到1L，分装至生根管中，116℃灭菌15min。

实验例1

选取水稻经组织培养获得的幼苗或种子直接作为供体，分别置于实施例1、3、12、13、14及对比例1-2制得的培养基上培养诱导生根、壮苗，培养条件控制为温度28-35℃，光照培养，定期观察。培养15d后统计：芽长、根长、根数、移栽后株高及移栽后存活率。

实施例14生根壮苗培养基(简写为S 0.2)诱导水稻试管苗生根壮苗结果如图1所示：试管苗经烯效唑处理后，与1/2MS培养基培养的试管苗相比，幼叶短宽厚，叶色深绿，健壮，生根快、根数多，根粗壮且根毛增多变长，结果见图1、3、4。因此，试管苗移栽后的抗倒伏能力强，存活率高，存活率可达到98％，返青快，即移栽2d后就出现返青，生长快，如图7。将植物种子直接生根壮苗表现出一致的效果，如图2。

对比例1培养基1/2MS和实施例1、3、12、13、14制得的培养基诱导结果见图1、4：试管苗在对比例1培养基1/2MS上培养生长较快，幼叶生长快但细长瘦弱，幼根细弱，容易造成幼叶徒长，移栽后存活率偏低，最高只能达到80％，返青时间长，一周后生长势显著弱于实施例14中幼苗，如图7。将植物种子直接生根壮苗表现出一致的效果，如图2和图5。

对比例1培养基1/2MS和对比例2培养基1/2MSIBA诱导试管苗生根壮苗结果如图6所示：试管苗在这些培养基上诱导生根，幼叶生长快但细长瘦弱，根虽多但细弱且短，容易造成幼叶徒长，移栽后存活率偏低，最高只能达到80％，且返青期长，约7-10天，如图7。

实施例14生根壮苗培养基(简写为S0.2)诱导水稻试管苗生根壮苗后的移栽结果见图7所示：经烯效唑处理的试管苗返青快，移栽7d后叶片比对照1/2MS绿，有明显的分蘖，且长势好，株高超过对照，如图7所示。

15d后测量株高，实验结果图8：尽管经烯效唑处理后的试管苗在移栽前明显矮于对照1/2MS，但移栽后，经烯效唑处理后的试管苗迅速适应环境，2天即开始返青，体现出生长优势，其株高渐渐超过对照，如图8所示。因此，本发明提供的培养基适用于水稻等植物的组培苗生根壮苗及后续移栽。将植物种子直接生根壮苗表现出一致的效果，如图9所示。

综合上述几种培养基生根壮苗效果对比可以发现，本发明使用的培养基试管苗矮壮、根壮且根毛增多变长，叶色深绿，宽厚，移栽后返青快，7d后试管苗叶色比对照绿，有明显的分蘖，且长势好。

综上，本发明提供的生根壮苗培养基通过合理添加不同浓度的烯效唑，使植物幼苗和对照比幼苗变矮壮，其叶色深绿，宽厚，且生根快、根粗且根毛多而长，移栽后，幼苗返青快，长势好，从而提高植物试管苗的移栽存活率，最终提高研究基因功能和组培育种的效率，且烯效唑对环境和植物本身也不会产生不良的影响。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。