本发明涉及一种蚂蟥室内人工冬眠方法，属于药用动物养殖领域。
二、
背景技术：
蚂蟥Whitmania pigra Whitman，又名宽体金线蛭，在动物分类学上隶属于环节动物门黄蛭科，其干燥全体为中药材水蛭，是2015版《中国药典》药材水蛭的主要基原动物，具有破血通经，逐瘀消癥的作用，是通心络胶囊、脑血康等众多治疗心脑血管疾病中成药的主要原料。近年来随着对蚂蟥研究的不断深入，其室外人工养殖方法已取得初步成功，供需矛盾有所缓解。
蚂蟥是变温动物，具有“冬眠”的习性，随着外界温度的降低，蚂蟥会通过减少或停止自身活动及进食而逐渐进入冬眠状态，以尽可能地降低自身新陈代谢和能量消耗，以利度过寒冷和冬季。但室外越冬时存在诸如水温、光照、雷电、降雨等不可控因素，造成蚂蟥种质成活率降低，降低产量和经济效益。室内越冬能有效控制蚂蟥冬眠环境，提高种蛭成活率，提高养殖经济效益。
三、
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种操作简便、蚂蟥能量消耗低并且成活率高的室内人工冬眠方法。
本发明选取健康蚂蟥在清水中暂养两天，不投食物，然后换曝气24h的自来水，同时使其所处黑暗环境的温度以1℃/12h或1℃/24h的速率降温，到4℃时可看到蚂蟥头部和尾部弯曲，呈现“弯月”状，说明蚂蟥已进入冬眠状态，维持环境温度处于4℃状态，期间及时换水保持养殖水质干净无浑浊。通过实验统计和比较发现，在60d的冬眠过程中，蚂蟥的体质量与初始值无明显差异，存活率可达100％，极显著高于室外自然越冬存活率(约60％)。本发明操作简便，在整个冬眠过程中蚂蟥能量消耗低，体重减少极低率高且存活率高。采用本发明一方面能够提高蚂蟥自然越冬的死亡率，减少自然越冬期间的体重下降；另一方面在非越冬期间可以随时让蚂蟥进入冬眠状态，以供科研之用，也可以让蚂蟥避免极度高温伤害；同时采用本发明可以有利于蚂蟥的长途运输。通过本发明可提高蚂蟥种蛭越冬存活率，直接增加了蚂蟥养殖的经济效益。具不完全统计，与现有室外自然越冬相比，采用本发明，可提高种蛭亩产约274.5kg，水蛭药材干品近40kg，按目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约4万元。
四、具体实施方式
1.材料
1.1实验材料及仪器：
蚂蟥由南京农业大学中药材研究所提供，经郭巧生教授鉴定为蚂蟥W.pigra。
MR200溶氧测量仪(南京特安科贸有限公司)、FYL-YS-108L低温保存箱(北京福意电器有限公司)，呼吸仪(自制)，XHF-D内切式匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，5810R离心机(Eppendorf公司)，Alpha-1506型紫外-可见分光光度计(上海谱元仪器有限公司)，FA 1104分析天平(上海精科天平)，ZD-2型自动电位滴定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。
2方法
2.1冬眠临界温度的确定
2.1.1耗氧量、耗氧率的测定
蚂蟥于试验前停食2d，每组随机选取3条10g左右体格健壮的蚂蟥(重复10次)，置于480mL注水2/3体积的广口玻璃瓶中。试验初始温度为25℃，以1℃·d-1的速率降温，分别于25，20，15，10，8，6，4，2℃稳定1d后观察记录蚂蟥在各温度下的活动状态，采用静水法进行耗氧量、耗氧率，测定总时间为4h。在水流入呼吸室的过程中，使用溶氧仪在进水口处测定水中的溶氧量标记为DOt1(mg·L-1)；当水充满后密闭呼吸室，准确计时4h后，测定出水中溶氧量标记为DOt2(mg·L-1)。
QC＝[(DOt1-DOt2)×V]·t-1·n-1，QR＝[(DOt1-DOt2)×V]·t-1W-1，QC为耗氧量(mg·h-1)，QR为耗氧率(mg·h-1·g-1)，/(L)为呼吸室中水的体积，W(g)为蚂蟥质量，n为蚂蟥条数，t(h)为密封时间。
2.1.2消化酶的测定
与2.1的实验设计相同，取各温度状态下蚂蟥消化道，采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定淀粉酶活力，规定在37℃条件下，单位体积的酶量1min水解淀粉生成1mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位；采用对-棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法测定脂肪酶活力，规定在37℃条件下，1min催化释放1μmol对硝基酚的酶量定义为1个酶活力单位；采用福林-酚法测定蛋白酶活力，规定每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。组织匀浆液蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250比色法测定。
2.2冬眠生长性能的测定
确定蚂蟥冬眠温度后，分别称量冬眠初始及冬眠60d体重，同时统计蚂蟥存活率。计算特定生长率(SGR)和增重率(WGR)。SGR＝100×(lnWt-lnW0)/t；WGR(％)＝100×(Wt-W0)/W0，式中W0为实验开始时蚂蟥的平均质量(g)，Wt为结束时蚂蟥的平均质量(g)，t为实验天数(d)。
2.3统计方法
试验所得数据先用Microsoft Excel作初步处理，然后采用SPSS 20.0软件包(One-Way ANOVE，LSD)进行分析，P＜0.05为差异显著。数据以表示。
3结果与分析
3.1不同温度下蚂蟥的活动状态
25℃时，蚂蟥活动极为活跃，尾部吸盘吸附于容器壁或者全体在水中“波浪式”游动；与25℃相比，20，15℃时蚂蟥活跃程度都有所下降，15℃时可见部分蚂蟥尾部吸盘吸附于容器壁呈“悬挂”静止状态，游动较少；10℃时，蚂蟥身体收缩逐渐静止于容器底部，无游动现象；4℃后，蚂蟥头部和尾部弯曲，呈现“弯月”状，不食不动伏于瓶底。整个实验过程无蚂蟥死亡。
3.2不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响
不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响结果见表1。随着温度的降低，蚂蟥的耗氧量、耗氧率逐渐下降。降温至4℃前，除6℃与8℃组无显著差异外，各温度组之间均有显著性差异(P＜0.05)，其中10℃前耗氧量、耗氧率降低趋势最明显，10℃后降低趋势逐渐减缓，4℃和2℃已无变化。
表1不同温度对蚂蟥耗氧量、耗氧率的影响
注：同一列中不同字母表示组间存在显著性差异(P＜0.05)，表2同。
3.3不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响
不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响结果见表2。随着温度的逐渐降低，蚂蟥消化道酶活性均呈不同程度降低趋势，与25℃相比各温度组消化酶活性均显著降低(P＜0.05)；10℃后，各酶活性降低趋势渐缓，4℃时各消化酶活性最低，与10℃和8℃相比，均呈显著性差异(P＜0.05)；4℃后各消化酶活性不再下降，基本保持稳定。
表2不同温度对蚂蟥消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响
3.4冬眠对蚂蟥生长性能的影响
冬眠对蚂蟥生长性能的影响结果见表3。以4℃为冬眠温度，60d的冬眠期间，蚂蟥体重仅降低了8.54％，整个试验期间无蚂蟥个体死亡，即其存活率可高达100％。
表3冬眠对蚂蟥生长性能的影响
3.5综合评判
本实验结果显示，当温度降低至4℃时，蚂蟥不食不动，其耗氧指标与消化酶指标由降低趋势逐渐稳定不变，说明4℃为蚂蟥冬眠的临界温度。此外，以4℃为冬眠温度处理60天的蚂蟥，体质量与冬眠初始值无显著差异，存活率高达100％(现有室外自然越冬种蛭存活率约为60％，体重减少约为30％)。与室外自然越冬相比，本发明方法可提高种蛭亩产约274.5kg，水蛭药材干品39.2kg(折干率7∶1)，按目前市场价1000元/kg计，每亩增加经济效益约3.92万元。
具体实施例1：
本发明选取10g左右健康蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)，按每平方米750尾密度将10公斤蚂蟥放置在一个塑料容器里，于清水中暂养48h以排出粪便，换水后往容器注水约8cm深曝气24h的自来水，在黑暗状态下，用温控装置将水温以1℃/12h或1℃/24h的速率降温至4℃，使蚂蟥进入冬眠状态，冬眠过程中，根据所处水质清浊状态换水，保持水质洁净，每次换水100％，不投喂饵料，除控温换水以外尽量减少和避免外界其他干扰刺激，以免打破其冬眠状态，造成机体能量大量消耗及死亡风险增加。
本发明阐述的实施例及权利要求并不是对本发明的限定，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化均落入本发明保护范围内。