本发明涉及植物组织培养技术领域。更具体地说，本发明涉及一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法。
背景技术：
烟草是重要的经济作物，也是植物生物技术研究重要的模式植物。所以，其植株再生技术的建立和批量生产“再生植株”(试管苗)对品种性状改良，良种快繁推广，特别是对定向获得性的确切验证，都具有重要的理论意义和实践意义。通过组织培养建立获得烟草再生植株技术体系的报导已有不少，其共同的突出缺点是程序繁杂，一般都分3个阶段：1、由不同的原始外植体(花粉、子房、子叶、胚轴、茎段、叶片、原生质体，等)诱导出愈伤组织；2、由愈伤组织诱导出不定芽(即无根苗)；3、由无根苗诱导出不定根，才能得到根苗齐全的完整再生植株。每一个阶段，都需要分别配制组成分(多为2-4种)及其相对比例皆不相同的培养基(诱导芽以细胞分裂素cytokinin为主，诱导根则以生长素auxin为主)，有时在同一个阶段还要连续继代培养数代，才能达到目标进入下一个阶段。而且在不同阶段，对培养环境条件的要求也不尽相同。因此，建立快速、简单、高效的烟草再生植株技术体系备受关注。
在各种不同的外植体中，以叶片最容易获得。李胜彬等人研究发表了关于烟草叶片直接再生植株及抗生素耐受性研究，其以5cm2叶切片为外植体，用MS固体培养基，添加复合诱导剂6-BA(N6-苄基腺嘌呤)0.1-0.5mg/L和IAA(吲哚乙酸)0.5mg/L，培养20d，每个切片收获再生植株5-10个，平均7.5个/切片。比以往技术有显著进步。但是，仍存在以下两个问题：①诱导剂仍需要2个成分复配；②实际收获再生植株数量不多，每个切片平均每天仅获得0.375个再生植株。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，其能够简化了培养基的配制，具有操作简单诱导再生植株速度快、产量高、质量好的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，取烟草叶片外植体，接种至添加有灵发素的MS固体培养基中，调节pH至5.8-6.0，培养30天，获得烟草再生植株。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，灵发素的浓度为3.0-5.0mg/L。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，灵发素的浓度为4.5mg/L。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，添加有灵发素的MS固体培养基经过无菌处理。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，所述烟草叶片外植体的获取方法为：烟草种子获得烟草无菌植株，长至5、6片叶时，取其自上而下的第3片叶，切除叶柄以上2mm、叶尖以下2mm的叶片部分，沿主脉两侧分切成方形切片，作烟草叶片外植体。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，沿主脉两侧分切成5mm×5mm的切片作烟草叶片外植体。
优选的是，所述的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，烟草叶片外植体的获取在无菌条件下进行。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明针对双子叶植物烟草的生物学特性，通过添加同时具有细胞分裂素和生长素生物活性的灵发素作唯一的诱导剂，激发诱导外植体内源相关活性物质的代谢方向与强度，形成一个适合叶片外植体植株再生的实时内环境，才能实现叶片外植体的植株再生；
第二、本发明经过反复的试验，确定灵发素的有效以及最适宜的浓度范围，既能够得到好的诱导效果，又不会在培养期间使培养材料发生褐化或玻璃化，中途无需更换新的培养基，同时避免多种植物生长调节剂的复配造成的步骤繁琐和人力物力的浪费；
第三、本发明用叶片外植体收获的再生植株，以每天、每1cm2面积计算其生产效率，可达到现有技术(李胜彬等2010年的方法)的1.7倍，而且质量更好(见表1)。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，以灵发素作为唯一诱导剂，添加灵发素3.0mg/L，调整培养基pH为5.8-6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：取由烟草种子获得的无菌烟草植株，在无菌条件下，将烟草叶片切成方形切片作为外植体，备用，方形切片可切成大小约为5mm×5mm；
步骤三、接种培养与记录：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，常规培养30天。
实施例2：
一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，以灵发素作为唯一诱导剂，添加灵发素4.5mg/L，调整培养基pH为5.8-6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：按常规方法用烟草种子获得无菌烟草植株，长至5、6片叶时，取其自上而下的第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm叶片部分和叶尖以下2mm叶片部分，再沿主脉两侧分切成方形切片，作烟草叶片外植体，方形切片可以切成大小约为5mm×5mm，备用，需要说明的是，前述的沿主脉切片是指弃用了叶片左右两侧的边缘叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；
步骤三、接种培养与记录：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，常规培养30天。
实施例3：
一种用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法，包括以下步骤：
步骤一、诱导培养基制备：以MS为基本培养基，以灵发素作为唯一诱导剂，添加灵发素5.0mg/L，调整培养基pH为5.8-6.0，灭菌后备用；
步骤二、外植体准备：按常规方法用烟草种子获得无菌烟草植株，长至5、6片叶时，取其自上而下的第3片叶，在无菌条件下，切除叶柄以上2mm叶片部分和叶尖以下2mm叶片部分，再沿主脉两侧分切成方形切片，作烟草叶片外植体，方形切片可以切成大小约为5mm×5mm，备用，需要说明的是，前述的沿主脉切片是指弃用了叶片左右两侧的边缘叶片部分，只要主脉两侧的叶片部分；
步骤三、接种培养与记录：将步骤二获得的烟草叶片外植体在无菌条件下接入步骤一的诱导培养基中，常规培养30天。
对比例1：
为了说明本发明的用灵发素诱导烟草叶片再生植株的方法的效果，本发明的发明人以实施例3的方法，将诱导培养基中的灵发素浓度依次设定为：3.0mg/L，3.5mg/L，4.0mg/L，4.5mg/L和5.0mg/L，并以参考李胜彬等2010年的技术配方下得到的培养基(其配方为：MS+IAA0.5mg/L+6-BA0.1mg/L)为对照组(CK)，培养基均调pH5.8-6.0，常规灭菌，在上述6组试验中每组接种10瓶，每瓶接种2个方形切片的烟草叶片外植体(烟草叶片外植体获取方法同实施例3)，按照实施例3的方法培养30天终止试验；
对对比例1的6组试验获得的烟草叶片再生植株，每组随机各取5瓶无污染者，统计：植株发生率＝发生再生植株切片数/接种切片数×100％；株数/切片、叶片数/株、根数/株。记录3批次平均值。结果如表1所示。
表1.不同浓度灵发素诱导烟草叶片再生植株的效果及其与传统技术(CK)的对比
表1中，序号6(CK)的配方参考李胜彬，等(2010)的研究结果拟定；叶片以展开成扇形者计数；根以肉眼可辨其长度(≥2mm)者计数。
由表1中6个案例对比得到，用灵发素单一诱导剂配制的烟草再生植株诱导培养基，其效果全面优于由IAA(吲哚乙酸)和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)复配成的传统诱导培养基：①在有效浓度之内，再生植株发生率(％)普遍高于CK组；②每个外植体切片(0.25cm2)日均获得株数平均是CK组的1.7倍[解释：(0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)/5/0.18＝1.66≈1.7]，最佳浓度4.5mg/L则达CK组的1.9倍(解释：0.34/0.18＝1.89≈1.9)。若将切片面积换算成1.00cm2，则每1.00cm2叶片外植体每天平均收获再生植株可达1.19个[解释：(0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)×4/5＝1.19]，是李胜彬，等(2010年)方法0.75个的1.6倍；③单株叶片数和根数都超过CK组，而且达到生产用苗的标准。所以，本发明所建立的技术方法是一种简单、高效、优质生产烟草再生植株的方法，具有实用价值。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。