一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生方法及应用与流程

文档序号:15485943发布日期:2018-09-21 19:49阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生后提取黄酮类化合物的方法,其特征在于它是按照以下步骤进行的:

一、在六月中旬至七月中旬,采摘无性系球果,消毒后,取种球未成熟合子胚,作为体细胞胚诱导外植体材料;

二、对步骤一的外植体材料进行干化处理:

1)将外植体材料置于放有多层滤纸的培养皿内,用封口膜将培养皿封口,然后将培养皿置于培养容器内,再向培养容器内倒入无菌水进行培养;

2)培养条件:在10~60μmol·m-2·s-1的光照、光照时间为12h、温度为22~25℃条件下培养1~3周,取胚轴及红色胚根作为下步处理的外植体材料;

三、将步骤二干化处理后的外植体材料在无菌条件下,接入到诱导培养基上,在温度为22~26℃、黑暗条件下诱导培养出胚性愈伤组织;

所述的诱导培养基中6-BA的浓度为0~2.0mg/L、萘乙酸浓度为1.0~5.0mg/L、水解酪蛋白浓度为0.7~1.0g/L、谷氨酰胺浓度为450~500mg/L、蔗糖浓度为20~25g/L、凝胶浓度为2~4g/L、激动素浓度为0.5~2.0mg/L和活性炭1~3g/L;pH控制在5.6~5.8;

四、体细胞胚的培养:

1)切取上一步骤获得的胚性愈伤组织按质量体积比为1g:10~20mL的比例将其加入到液体培养基中混合,然后过滤,过滤掉液体培养基,将剩余的胚性愈伤组织置于诱导培养基上,在温度为20~25℃、13~15h的光周期、光照强度为1200~1800Lx的条件下进行培养20~30d,得愈伤组织;

诱导培养基为3/4MS培养基;其中,6-BA浓度为0.1~2.0mg/L、玉米素ZT浓度为0.3~1.5mg/L、蔗糖浓度为20~25g/L、水解酪蛋白浓度为0.7~1.0g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为2~4g/L;

2)将在上步诱导培养基上培养的愈伤组织转移至诱导出芽培养基上,在温度为18~22℃、10~12h的光周期、光照强度为1000~1500Lx的条件下,培养15d;

诱导出芽培养基为1/2MS培养基;其中,赤霉素浓度为0.1~1.0mg/L、萘乙酸浓度为0.01~0.1mg/L、谷氨酰胺浓度为500mg/L、蔗糖浓度为30~40g/L、活性炭浓度为1mg/L以及凝胶浓度为7~8g/L;

3)将上步培养后长出的不定芽在温度为18~22℃、10~12h的光周期、光照强度为1000~1500Lx的条件下培养4~5d,然后喷洒280~320mg/L的乙烯利,并用蓝光照射3~5h,继续在温度为18~22℃、10~12h的光周期、光照强度为1000~1500Lx的条件下培养1d,然后转移至生根培养基上,在光照时间为15~20h、温度为22~25℃条件下培养20~30d;所述在生根培养基上培养的光照条件为:在第1~10d光照为5~10μmol·m-2·s-1,在第11~18d光照为15~20μmol·m-2·s-1,在第19~30d光照为25~40μmol·m-2·s-1

生根培养基为1/2MS培养基;其中,吲哚乙酸浓度为0.1~5.0mg/L、蔗糖浓度为10~30g/L以及凝胶浓度为2~8g/L;

五、炼苗:在不定根生长至1.0~1.5cm,打开试管瓶口,在自然光照下,炼苗3~5d,取出后,栽入到腐殖土+珍珠岩+蛭石+禽畜粪便按质量比6∶4∶3∶1的比例混合的基质上,即完成所述的红皮云杉体细胞胚诱导植株再生;

六、将上步再生植株移栽后,收获其种子进行萌发,再移栽,对移栽后的树木提取黄酮类化合物;

所述的萌发是按照以下步骤进行的:

1)、在8~10月收获种子,将种子与雪按照1:3的重量比混合后置于深、宽均为1m的沟内,上面覆盖雪和覆土,并覆盖秸秆;其中,沟底垫10~15cm的积雪;

2)、在播种前5d将种子取出,种子用40~50℃浸泡1~2d,浸泡期间搅动5~6次;然后在23~26℃温度下自然晾晒2~3d;

3)、将湿沙与种子按照重量比为3:1的比例混合,放置于背阴处,在温度为5~8℃下培养至出芽,在出芽当天,首先,喷洒280~320mg/L的乙烯利,喷洒后将温度升温至15℃或20℃后,立即降温至5~8℃,然后采用蓝光照射3~4h,继续在温度为5~8℃下培养1~2d,即完成所述的萌发。

2.根据权利要求1所述的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生后提取黄酮类化合物的方法,其特征在于提取黄酮类化合物的过程如下:

一、将萌发后的幼苗移栽;

二、取步骤一移栽多年后风干的红皮云杉叶片粉碎,过筛,备用;

三、按物料比为1g:8~12mL的比例向过筛后的粉末中加入体积浓度为45~60%的乙醇,置于匀浆机中,在温度为60~70℃,匀浆2~6min,得匀浆液;将匀浆液中乙醇去除后,再按物料比为1g:18~20mL的比例加入体积浓度为50~70%的乙醇,浸泡0.5~1.5h,然后在微波功率为250~300W、温度为60~80℃的条件下,提取4~7min,得提取液;

四、按体积比为1:1的比例,向步骤三得到的提取液加入乙醚,振荡萃取30~35min,收集萃取相;对乙醚萃取余相重新按照上述体积比加入乙醚进行萃取;

五、重复步骤四操作2~3次,合并萃取相;

六、对步骤五的萃取相进行减压浓缩,将浓缩后的浓缩液过硅胶柱层析进行分离,收集洗脱液;减压浓缩,即完成所述的黄酮类化合物提取。

3.根据权利要求1所述的一种红皮云杉体细胞胚诱导植株再生后提取黄酮类化合物的方法,其特征在于所述的黄酮类化合物为异黄酮、二氢异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮和二氢查耳酮。

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