一种西藏虎头兰茎尖微滴玻璃化法超低温保存方法与流程

本发明涉及植物细胞工程学领域。具体涉及西藏虎头兰茎尖微滴玻璃化法超低温保存方法。

背景技术：

西藏虎头兰为兰科兰属(学名：cymbidiumtracyanuml.)：附生植物；假鳞茎椭圆状卵形或长圆状狭卵形，长5-11厘米，宽2-5厘米，大部分包藏于叶鞘之内。叶5-8枚或更多，带形。花葶从假鳞茎基部穿鞘而出，外弯或近直立；总状花序通常具10余朵花；花大，直径达13-14厘米，有香气；萼片与花瓣黄绿色至橄榄绿色，有多条不甚规则的暗红褐色纵脉；花瓣镰刀形，下弯并扭曲，长4.5-6.5厘米，宽7-12毫米；唇瓣卵状椭圆形，长4.5-6厘米，3裂。蒴果椭圆形。花期9-12月。西藏虎头兰花大色艳，花直径达10-12cm，具有很高的观赏价值，可以作为杂交亲本(大花蕙兰)。西藏虎头兰在中国分布面积比较小，只在贵州西南部、云南、广西西北部和西藏东南部有分布，但是数量非常少。西藏虎头兰用种子或分株法繁殖，其种子在自然条件下极难萌发，自然繁殖率低。

超低温保存一般是指使用液氮(-196℃)或液氮蒸汽保存生物材料的技术和方法。在液氮温度下，细胞中所有的生化反应都被暂时停止，从而可以使细胞在理论上进行无限期保存。超低温保存技术广泛应用于微生物、动物和植物种质资源的长期保存。兰科植物的超低温保存研究基本都集中在种子，圆球茎和类圆球茎的超低温保存上。兰科植物种子的超低温保存是兰科植物种质资源保存的重要途径。由于兰科种子微小，可以一次保存大量种子，可以保存多样性的基因资源。兰科植物成熟种子超低温保存是可行和高效的。但兰科植物特别是地生兰成熟种子存在萌发困难的问题。利用玻璃化途径进行兰科植物种子的超低温保存，现有的研究看来对成熟种子和未成熟种子都非常高效。

迄今，未见有西藏虎头兰茎尖微滴玻璃化法超低温保存方法的报道。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种西藏虎头兰茎尖微滴玻璃化法超低温保存方法，超低温保存茎尖的存活率和再生率更高，解冻后的茎尖在恢复培养阶段生长更为迅速，以解决现有技术中导致的上述多项缺陷。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种西藏虎头兰微滴玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：

1)材料获取，在西藏虎头兰离体植株上取大约2mm长的节段，将节段在无菌条件下接入vw基础培养基；

2)茎尖切割，在体视镜下，以三叶阶段的类圆球茎为材料，切割茎尖，茎尖体积约为1mm3，将外层的两片叶原基切去，得到的茎尖由最后一片叶原基包裹；

3)茎尖预培养，切割得到的茎尖在预培养培养基上暗处理和25℃下预培养48小时；

4)加载处理，将茎尖在加载溶液中，25℃下处理20分钟；

5)植物微滴玻璃化处理，将茎尖转入预冷的pvs2溶液，在冰上处理20-40分钟；

6)超低温保存，将经过pvs2处理的茎尖转移到无菌铝箔条上并插入液氮，待降温过程完成后转入冻存管并进入液氮罐保存；

7)解冻和卸载处理，将铝箔条从液氮中移出并直接转入卸载溶液，在25℃下处理20分钟；

8)恢复培养，将解冻后的茎尖转移到恢复培养基上进行恢复培养。

优选的，所述步骤1)中，vw基础培养基内添加有0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel。

优选的，所述步骤3)中，预培养培养基为添加0.3m蔗糖和0.3％(w/v)phytagel的vw基础培养基。

优选的，所述步骤4)中，加载溶液为添加2m甘油和0.4m蔗糖的vw基础培养基。

优选的，所述步骤5)中，pvs2溶液为添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)dmso和0.4m蔗糖的vw基础培养基。

优选的，所述步骤7)中，卸载溶液为添加1.2m蔗糖的vw基础培养基。

优选的，所述步骤8)中，将茎尖直接转入恢复培养基。

优选的，所述步骤8)中，转入vw基础培养基添加0.3m蔗糖平板，2天或6天后转入恢复培养基。

优选的，所述步骤8)中所述恢复培养基为添加30gl-1蔗糖、1.0mgl-1ba和3gl–1phytagel的vw基础培养基。

采用以上技术方案的有益效果是：本发明的技术方案中超低温保存茎尖的存活率和再生率更高，解冻后的茎尖在恢复培养阶段生长更为迅速。

附图说明

图1为预培养时间对西藏虎头兰茎尖超低温保存后再生率的影响示意图；

图2为解冻后渗透处理对西藏虎头兰茎尖超低温保存后再生率的影响示意图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的优选实施方式。

本发明的具体实施方式：一种西藏虎头兰微滴玻璃化超低温保存方法，包括以下步骤：

1)材料获取，在西藏虎头兰离体植株上取大约2mm长的节段，将节段在无菌条件下接入vw基础培养基，vw基础培养基内添加有0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel；

2)茎尖切割，在体视镜下，以三叶阶段的类圆球茎为材料，切割茎尖，茎尖体积约为1mm3，将外层的两片叶原基切去，得到的茎尖由最后一片叶原基包裹；

3)茎尖预培养，切割得到的茎尖在预培养培养基上暗处理和25℃下预培养48小时，预培养培养基为添加0.3m蔗糖和0.3％(w/v)phytagel的vw基础培养基；

4)加载处理，将茎尖在加载溶液中，25℃下处理20分钟，加载溶液为添加2m甘油和0.4m蔗糖的vw基础培养基；

5)植物微滴玻璃化处理，将茎尖转入预冷的pvs2溶液，在冰上处理20-40分钟，pvs2溶液为添加30％(w/v)甘油、15％(w/v)乙二醇、15％(w/v)dmso和0.4m蔗糖的vw基础培养基；

6)超低温保存，将经过pvs2处理的茎尖转移到无菌铝箔条上并插入液氮，待降温过程完成后转入冻存管并进入液氮罐保存；

7)解冻和卸载处理，将铝箔条从液氮中移出并直接转入卸载溶液，在25℃下处理20分钟，卸载溶液为添加1.2m蔗糖的vw基础培养基；

8)恢复培养，将解冻后的茎尖转移到恢复培养基上进行恢复培养。

恢复培养是将在卸载溶液处理结束后，将茎尖直接转入恢复培养基，或者转入vw基础培养基添加0.3m蔗糖平板，2天或6天后转入恢复培养基。另外一组对照实验中，茎尖在解冻后直接转入恢复培养基。

恢复培养基为添加30gl-1蔗糖、1.0mgl-1ba和3gl–1phytagel的vw基础培养基，恢复培养的前7天为暗培养，解冻后前7天为暗处理，后转入光下。恢复培养4周以后在显微镜下统计再生率。明确表现生长和形成新类圆球茎的超低温保存茎尖为再生。

实施例1：

1.类圆球茎的诱导：在西藏虎头兰离体植株上取大约2mm长的节段，将节段在无菌条件下接入添加了0.06m蔗糖，2.27μmthidiazuron(tdz)和3g/l的phytagel的vw培养基。培养条件为25℃，14/10h(光/暗)的光照周期，光强为40μmolm^-2s^-1。将诱导得到的类圆球茎作为以细胞薄层培养扩繁类圆球茎的起始材料。

2.通过细胞薄层培养扩繁类圆球茎

在体视显微镜下，用无菌的镊子和手术刀徒手制备类圆球茎细胞薄层。将剑叶虾脊兰和细花虾脊兰的类圆球茎做横切，得到厚度大约为0.5毫米左右的细胞薄层。将细胞薄层切片接种到添加了0.06m蔗糖和3gl-1phytagel的vw培养基，并在上述培养条件下培养。培养第二周，细胞薄层开始产生新的类圆球茎。培养第7周，新的类圆球茎开始产生叶原基。三个叶片阶段的类圆球茎被收集和用于切割茎尖。

3.茎尖的切割：在体视镜下，以三叶阶段的类圆球茎为材料，切割茎尖。茎尖体积约为1mm³。将外层的两片叶原基切去，得到的茎尖由最后一片叶原基包裹。

4.茎尖预培养，切割得到的茎尖在预培养培养基上暗处理和25℃下预培养48小时。

5.微滴玻璃化超低温保存。

将茎尖切割后在预培养基上，暗处理和25℃下预培养48小时。预培养基的组成为vw+0.3m蔗糖+0.3％(w/v)phytagel。预培养后的茎尖在25℃下loadingsolution处理20分钟。loadingsolution的组成为vw培养基添加2m甘油和0.4m蔗糖。loadingsolution处理结束后，移掉loadingsolution，加入1ml预冷的pvs2在冰上处理一定的时间。pvs2处理结束后将茎尖转入铝箔并插入液氮保存。解冻时将带有茎尖的铝箔从液氮中取出，直接插入6厘米直径培养皿中10mlunloadingsulution中，unloadingsolution的组成为vw+1.2m蔗糖。解冻完成后，茎尖直接转入恢复培养基，或者转入vw+0.3m蔗糖平板，2天或6天后转入恢复培养基。另外一组对照实验中，茎尖在解冻后直接转入恢复培养基。解冻后前7天为暗处理，后转入光下。恢复培养四周以后在显微镜下统计再生率。明确表现生长和形成新类圆球茎的超低温保存茎尖记为再生。

本发明中，测试了茎尖在添加0.3m蔗糖的预培养基预培养24，48，72和96小时后的超低温保存再生率。经过24小时预培养的茎尖的超低温保存再生率仅为7.5％(图1)。当预培养时间为48小时，超低温保存茎尖的再生率上升到17.5％(图1)。当预培养时间延长到72小时时，再生率进一步显著性的上升到25％(图1)。预培养96小时后茎尖的再生率达到了30％(图1)。可见预培养对超低温保存西藏虎头兰茎尖很重要。

本发明中，测试了解冻后渗透处理对西藏虎头兰超低温保存茎尖的再生率有重要的影响。在解冻后不做渗透处理，直接转入恢复培养基的情况下，再生率仅为3.3％(图2)。当对解冻后的茎尖进行2天的渗透处理后，再生率上升到10％，但次结果与对照组并无显著差异(图2)。当渗透处理被延长到6天时，再生率被显著提升到了61.7％(图2)。

实施例2：

西藏虎头兰茎尖超低温保存茎尖存活和再生情况

在优化的超低温保存条件下，超低温存的茎尖在解冻后1周即可见到再生的迹象。存活的茎尖经过四周的恢复培养可以产生新的类圆球茎。超低温保存茎尖产生1或2个新类圆球茎的情况都有发生。新类圆球茎在转入不添加激素的vw半固体培养基后可以发育成完整的试管苗。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。