一种植物小分子核糖核蛋白RNA在害虫防治中的应用的制作方法

本发明涉及植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)在害虫防治中的应用，具体涉及植物来源srRNA-348-25影响昆虫生长的这一功能，从而围绕srRNA-348-25开展转基因或抑制剂研发，达到害虫防治的目的。

背景技术：

自从1993年发现小分子干扰RNA以来，大量各类小分子RNA被发现，包括了miRNAs、siRNAs、piRNAs和snRNAs等。miRNA是一类长度约21～24核苷酸非编码的小分子RNA，广泛存在于动、植物体中。一系列实验表明miRNA可能是一类在进化上保守的、在生物体中具有重要调控作用的分子。miRNA源自细胞核内编码miRNA的基因转录成pri-microRNA，接着被Drosha酶剪切为长度约70bp呈发夹状的pre-miRNA，随后被核质/细胞质转运蛋白从细胞核内转运到胞质中，之后被Dicer酶剪切成长为18-26bp的miRNA双螺旋复合体。其中一条解螺旋，并与AGO蛋白结合，并形成非对称的RISC复合物。这个复合物通过其中的miRNA与靶mRNA的3’UTR互补配对结合，从而降解靶目标mRNA或阻断其翻译，实现对靶标基因的负调控。已有大量文献报道，miRNA在基因表达、信号转导、植物发育、抵抗胁迫、预防疾病等方面起着至关重要的作用。近年来一类来源于核糖核蛋白DNA的小分子RNA(srRNAs)被发现具有类似miRNA的功能。例如从人类和老鼠的小分子RNA高通量测序结果分析，发现大量的srRNAs是可以和核糖核蛋白DNA配对的，同时免疫共沉淀实验表明这些srRNA可以和AGO结合；实验还表明一些srRNA可能参与了调控糖尿病的相关代谢途径(Haibin Wei,Ben Zhou,Fang Zhang,Yanyang Tu,Yanan Hu,Baoguo Zhang,Qiwei Zhai.Profiling and Identification of Small rDNA-Derived RNAs and Their Potential Biological Functions.PLOS ONE.2013.8(2):e56842)。但是srRNA的研究报道极少，更没有在昆虫与植物关系方面的研究报道。

技术实现要素：

本发明在对害虫斜纹夜蛾进食芥菜的差异小分子RNA进行测序分析时，发现了表达量显著下调的srRNA-348-25：5’-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3’(SEQ ID NO:1)并鉴定为植物中普遍存在的保守序列。注射srRNA-348-25片段进入虫体，进食植物叶片的斜纹夜蛾死亡率显著增加。由于srRNA-348-25为植物小分子核糖核蛋白RNA，较多的存在于富含蛋白的植物中，如大豆，特别在加热的大豆中，因此，该片段对人是安全的。可用作为安全有效的防治植食性害虫的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物。

本发明的目的在于提供植物srRNA-348-25在制备杀虫剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种植物小分子核糖核蛋白RNA在制备杀虫剂中的应用，所述小分子核糖核蛋白RNA为srRNA-348-25，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述杀虫剂能够杀灭植食性虫体，或抑制植食性虫体的生长。

进一步的，所述植食性虫体为鳞翅目植食性昆虫、同翅目植食性昆虫。

进一步的，所述鳞翅目和同翅目昆虫为斜纹夜蛾、蚕、稻飞虱。

一种杀虫剂，该杀虫剂中含有srRNA-348-25，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种植物虫害防治的方法，其特征在于：使植物体过表达小分子核糖核蛋白RNA srRNA-348-25，srRNA-348-25碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的有益效果是：

本发明发现一种植物小分子核糖核蛋白RNA(srRNA-348-25)对植食性害虫生长具有抑制作用，甚至能够促进植食性害虫的死亡，由于srRNA-348-25是人类食用植物中的成分，对人类安全，可用作安全有效的防治植食性害虫的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物；因此srRNA-348-25转基因植物(即植物体过表达srRNA-348-25)进行害虫防治将有着实际的应用价值。

附图说明

图1为注射srRNA-348-25后斜纹夜蛾幼虫进食芥菜后的死亡情况；图中NC mimic即为NC(无义片断)对照组，sr-348-25为srRNA-348-25的简称；

图2为注射srRNA-348-25 72h后斜纹夜蛾幼虫的生长情况；图中sr-348-25为srRNA-348-25的简称；

图3为srRNA-348-25在不同植物中的表达水平；图中食物为斜纹夜蛾虫体人工培养基，经加热而成；图中豆粉、麦麸为未加热的材料；芥菜为其叶片；

图4不同原料中srRNA-348-25的相对含量检测；

图5为斜纹夜蛾进食芥菜(B.juncea)和培养基(CK)后中肠srRNA-348-25含量的检测；

图6为注射srRNA-348-25进入斜纹夜蛾幼虫后解毒酶SlGSTe1表达下调，图中NC为注射无义序列的对照组；

图7为分别喂食含srRNA-348-25的培养基和芥菜的斜纹夜蛾生长的比较；

图8为多种植物基因组中srRNA-348-25序列的比较分析；

图9为分别注射2μg srRNA-348-25和无义序列(NC)的家蚕表型；

图10为srRNA-348-25增加稻飞虱的死亡率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

本发明的研究过程如下所述：

为了研究杂食性农业害虫斜纹夜蛾适应植物的机制，我们分别对进食含大豆和麦麸的人工培养基以及芥菜叶片的斜纹夜蛾中肠，进行了高通量小分子RNA测序与分析，发现了斜纹夜蛾中肠差异表达最大的小分子RNA，进一步研究发现该小分子RNA不与斜纹夜蛾基因组序列配对，而是存在植物基因组中，是26S rRNA的一段序列，属于小分子核糖核蛋白RNA，命名为srRNA-348-25。

srRNA-348-25在蛋白含量高的培养基中含量高，而在芥菜叶中含量很低；并且它在加热培养基中的含量高于不加热培养基，说明了它可能是蛋白复合体的降解产物。因此在进食芥菜后的斜纹夜蛾中肠中srRNA-348-25含量极低，但如果增加它在斜纹夜蛾体内的含量，斜纹夜蛾进食芥菜叶会导致死亡。

分析斜纹夜蛾进食培养基和芥菜后的中肠中的基因表达谱，发现斜纹夜蛾以蛋白水解酶应对大豆的高蛋白、以解毒酶应对毒性的植物次生物质。分析srRNA-348-25的靶基因，发现它可能抑制解毒酶基因，而不作用蛋白水解酶。因此，斜纹夜蛾进食高含量srRNA-348-25的培养基并不死亡，但体内含高剂量srRNA-348-25的斜纹夜蛾进食芥菜后死亡率大增。所以可利用srRNA-348-25防治斜纹夜蛾。

由于srRNA-348-25在植物叶中含量极低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治进食其他植食性昆虫？我们分别注射srRNA-348-25进入鳞翅目的家蚕和同翅目的稻飞虱，它们进食植物后死亡率增加。由于srRNA-348-25是人类食用植物中的成分，对人类安全，因此srRNA-348-25转基因植物进行害虫防治将有着实际的应用价值。

实施例1srRNA-348-25抑制斜纹夜蛾进食芥菜后的生长和存活

实验方法：

选取大小一致、健康状况一致的五龄第一天斜纹夜蛾幼虫，称量每头虫子的重量，随机分为srRNA-348-25处理组和NC对照组(无义片段)，每组40头，重复实验3次。顺血液循环流动方向，用微量注射器从斜纹夜蛾幼虫的侧腹部第一和第二腹足之间，分别注射srRNA-348-25和NC(无义片段)，注射量为每头虫4μg，注射后喂食芥菜。注射后第1、2、3天观察虫子的形态变化并拍照取证，每天统计虫子的死亡率。

上述srRNA-348-25序列为：5’-GUCGGGAGGGAAGCGGAUGGGGGCC-3’(SEQ ID NO：1)。

实验结果：

实验检测结果如图1和图2所示，图1为注射srRNA-348-25后斜纹夜蛾幼虫进食芥菜后的死亡情况；从中可以看出注射srRNA-348-25的斜纹夜蛾幼虫在进食芥菜24h、48h和72h后的死亡率分别达77.50％、92.45％和92.45％，远远高于对照组(NC)的6.91％、8.69％和8.69％。图2为注射srRNA-348-25或无义片段(NC)的斜纹夜蛾幼虫在进食芥菜72h后的生长情况，从中可以看出在srRNA-348-25处理组中存活的幼虫瘦小，而NC对照组的幼虫明显肥大许多。

上述结果说明srRNA-348-25抑制斜纹夜蛾进食芥菜后的生长和存活。

实施例2srRNA-348-25的来源及其对斜纹夜蛾虫体的影响

为了研究小分子RNA调控杂食性农业害虫斜纹夜蛾适应植物的机制，分别对进食含大豆和麦麸的人工培养基以及芥菜叶片的斜纹夜蛾中肠，进行了高通量小分子RNA测序与分析，发现了斜纹夜蛾中肠差异表达最大的一个小分子RNA，进一步研究发现该小分子RNA不与斜纹夜蛾基因组序列配对，而是存在植物基因组中，是26S rRNA的一段序列，属于小分子核糖核蛋白RNA，命名为srRNA-348-25。

一、srRNA-348-25在不同植物中的表达情况

实验方法：

分别将斜纹夜蛾虫体人工培养基(每升培养基中含黄豆粉100g、麦麸80g、酵母粉26g、干酪素8g、维生素C 8g、氯化胆碱1g、山梨酸2g、胆固醇0.2g、肌醇0.2g和琼脂粉26g)、豆粉、麦麸、芥菜叶片按Trizol法抽提总RNA，测定浓度后取2μg总RNA进行反转录(参考TAKARA的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit说明书进行)，得到的cDNA产物稀释后用于qRT-PCR的模板，进一步qRT-PCR检测srRNA-348-25在各个样本中的表达水平。结果分析采用相对定量的方法来确定目标基因相对内标基因(GAPDH，HQ012003)的相对表达倍数。应用SPSS16.0统计分析软件，采用ANOVA(多个处理间的两两比较)或独立样本T检验(两个样品间比较)来进行处理间的差异比较分析。

实验结果：

检测结果如图3所示，从中可以看出，人工培养基(食物)中的srRNA-348-25含量最高，豆粉中的srRNA-348-25含量也明显高于麦麸，表明培养基中的高含量srRNA-348-25可能主要是由豆粉所致；然而芥菜叶片中的srRNA-348-25含量非常低。

实验方法：

为了进一步明确豆粉加热后srRNA-348-25含量可能会增加，分别取0.1g豆粉、0.1g麦麸、0.1g按1:1混合的豆粉和麦麸的混合物(其中分别设置了未加热的及按培养基加热方式处理后的豆粉和麦麸混合物、0.1g水稻叶片、0.1g花生叶片、0.1g酵母，进行与上述完全相同的RNA提取、反转录和PCR等操作，分别各取1μg RNA进行反转录和相同体积的PCR。

实验结果：

检测结果如图4所示，从中可以看出，豆粉中的srRNA-348-25的表达量远高于在麦麸、花生和水稻叶片中的；加热后的豆粉和麦麸混合物中srRNA-348-25表达量相对未加热的明显增加，表明豆粉中的蛋白加热后，较多核糖核蛋白体RNA生成小分子RNA。

上述结果提示srRNA-348-25在植物叶片中含量很低；在蛋白含量高的培养基中的含量高，并且在加热后的培养基中的含量高于不加热培养基，进一步说明srRNA-348-25可能是蛋白复合体的降解产物。

二、斜纹夜蛾进食芥菜后srRNA-348-25的相对含量检测

将五龄第二天的斜纹夜蛾分为2组，每组分别喂食芥菜叶片(B.juncea)和人工培养基(CK)，分别于喂食后12h和48h，检测斜纹夜蛾中肠中srRNA-348-25的含量情况。

检测结果如图5所示，从中可以看出，无论是进食后12h或48h，斜纹夜蛾进食芥菜后其体内的srRNA-348-25的含量较进食培养基的少。由于培养基中srRNA-348-25含量远高于芥菜叶中的含量(图3)，因此本结果表明斜纹夜蛾进食后中肠中srRNA-348-25的含量与其在食物中srRNA-348-25的含量成正比。由于昆虫在长期的进化中对不同的食物形成了不同的适应机制，斜纹夜蛾分别进食含有不同含量srRNA-348-25的培养基和或芥菜片时均不会死亡。然而我们的研究发现，当增加斜纹夜蛾体内srRNA-348-25含量(体外注射srRNA-348-25)后再进食芥菜时，斜纹夜蛾生长受抑制且死亡率增加(见图1和图2)。

实施例3srRNA-348-25抑制进食芥菜后斜纹夜蛾生长且促进其死亡的机制

一、srRNA-348-25的作用靶标

为了进一步研究srRNA-348-25抑制斜纹夜蛾生长且促进其死亡的可能机制，我们将斜纹夜蛾进食培养基后再转进食芥菜，然后分别在转进食芥菜后的0、6、48h采集样品进行高通量测序，分析差异表达基因，如表1和表2所示。

结果发现转进食芥菜后，斜纹夜蛾中肠的许多蛋白水解酶表达下调(表1)，而许多应对芥菜次生物质的解毒酶的表达量上调(表2)。进而将srRNA-348-25与表1和表2中具有表达差异的靶基因序列进行配对分析，检测srRNA-348-25可能作用的靶标，结果发现srRNA-348-25与检测到的具有表达差异的蛋白水解酶基因不具有结合有可能性(完全不配对)；但与表2中检测到的一些解毒酶等基因具体有结合的可能性；进一步的研究发现，srRNA-348-25可能与解毒酶基因Slgste1(这是一个保障斜纹夜蛾应对芥菜次生物质的重要基因，它在斜纹夜蛾进食培养基时几乎不表达，可参见Xiaopeng Zou,Zhibin Xu,Haiwang Zou,Jisheng Liu,Qili Feng,Sichun Zheng.Glutathione S-transferase SlGSTE1in Spodoptera litura may be involved in feeding preference of host plants.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2016，70:32-43)的3’非编码区具有结合作用。

表1.斜纹夜蛾从进食培养基转进食芥菜后表达差异显著的蛋白水解酶基因数统计

表2.斜纹夜蛾从进食培养基转进食芥菜后表达差异显著的解毒酶基因数统计

为了进一步研究srRNA-348-25是否作用于解毒酶基因Slgste1，我们将srRNA-348-25注射进入五龄的斜纹夜蛾幼虫，检测Slgste1基因的在转录水平的表达情况；检测结果如图6所示，从中可以看出，注射srRNA-348-25后，斜纹夜蛾幼虫体内Slgste1基因的转录表达水平明显降低，说明srRNA-348-25抑制Slgste1基因表达。

二、表型分析

实验方法：

一共设置5组实验，各组处理情况如下：

对照组(单纯水)：给斜纹夜蛾单纯喂食水，如图7A；

实验组(单纯水srRNA)：给斜纹夜蛾单纯喂食srRNA-348-25，与水比较，证明srRNA-348-25是否无毒性，如图7A；

对照组(培养基)：使斜纹夜蛾进食人工培养基，如图7B；

实验组(2μg srRNA+培养基)：使斜纹夜蛾进食含2μg srRNA-348-25的人工培养基，如图7B和图7C；

实验组(2μg srRNA+芥菜)：使斜纹夜蛾进食含2μg srRNA-348-25的芥菜，如图7C；

按照上述处理，分别观察各组斜纹夜蛾幼虫的生长和死亡情况。

观察结果如图7所示，从图7A中可以看出，单纯的2μg srRNA-348-25不影响斜纹夜蛾的生长发育，说明srRNA-348-25可能不作用任何与生长相关的基因；从图7B中可以看出，进食含2μg srRNA-348-25的培养基的斜纹夜蛾与进食单纯培养基的斜纹夜蛾相比，生长并没有受到抑制，表明srRNA-348-25也不调控与培养基成分相关的基因如蛋白水解酶的表达；从图7C中可以看出，进食含2μg srRNA-348-25的培养基和芥菜的斜纹夜蛾，后者的生长明显小于前者，说明当虫体富集2μg srRNA-348-25时再食用芥菜会抑制斜纹夜蛾的生长，促进虫体的死亡，其中的作用机制很可能是由于srRNA-348-25抑制了Slgste1等解毒酶基因(虫体分解有毒的植物次生物质所必需的酶)的表达，使芥菜的毒性增加，最终导致虫体的进食与生长受阻，从而促进虫体的死亡。

实施例4不同植物基因组中srRNA-348-25序列的比较分析

由于srRNA-348-25序列无法在斜纹夜蛾基因组中找到配对的序列，因此我们分别选取了几个植物基因组进行了比较分析，包括了大豆(基因库序列号：dbj|LB172039.1)、上羊草(基因库序列号：gb|AOCO010307372.1)；拟南芥(基因组编号：TAIRIO)。比对结果如图8所示，srRNA-348-25在植物中非常保守，是26s rRNA的一段序列，这解释了为什么它在高蛋白的大豆中含量较高，而在各类植物的叶片中含量皆低。因此，理论上转基因srRNA-348-25，增加各类植物的叶片它的含量，都有可能会到导致进食该类植物的害虫产生不良的反应。

实施例5srRNA-348-25抑制家蚕的生长

由于srRNA-348-25在植物叶中含量极低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治进食其他植食性昆虫？本实施例对鳞翅目的家蚕进行了相应的研究。

分别取5龄3天的家蚕，注射2μg srRNA-348-25和无义对照序列，注射完后是否还要对家蚕进食桑叶，观察家蚕的生长情况。

观察结果如图9所示，从中可以看出，注射srRNA-348-25后72天，家蚕的生长情况明显受到抑制，生长抑制率为100％。

实施例6srRNA-348-25促进稻飞虱的死亡

由于srRNA-348-25在植物叶中含量极低，那么srRNA-348-25是否也可以用于防治进食其他植食性昆虫？本实施例对水稻的主要害虫同翅目的稻飞虱分别注射0.2μg srRNA-348-25和无义序列(对照组)，注射体积为0.2μl，注射完后是否还要对稻飞虱进食水稻叶(即注射完后将稻飞虱放到水稻中)，观察稻飞虱的生长情况。

观察结果如图10所示，从中可以看出，注射srRNA-348-25后2天，srRNA-348-25的死亡率为86％，而对照组的死亡率仅为33％。

上述结果说明增加稻飞虱体内srRNA-348-25的含量，也会促使稻飞虱进食水稻叶后的死亡率，进一步证明srRNA-348-25能够促进植食性的昆虫的死亡率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南师范大学

<120> 一种植物小分子核糖核蛋白RNA在害虫防治中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

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