一种可无需解剖判断黄喉拟水龟胚胎发育时相的方法与流程

本发明属于温度决定型性别决定动物性别分化和性别调控领域，特别是涉及一种可无需解剖判断黄喉拟水龟胚胎发育时相的方法。
背景技术：
：黄喉拟水龟(MauremysmuticaCantor1842)隶属爬行纲(Reptilia)、龟鳖目(Testudinata)、淡水龟科(Emydidae)、拟水龟属(Mauremys)，由于自然繁殖能力有限，已成为濒危物种，列入“濒危野生动植物物种国际贸易公约(CITES)”。研究表明，黄喉拟水龟属于温度性别决定型动物，即其繁殖后代的性别取决于受精卵孵化过程中的某一特定时段(温度敏感期)。在此期间高温孵化会产生较多雌性龟苗，反之产生较多雄性龟苗。近年来黄喉拟水龟备受人们的关注，特别的两广一带。由于温度性别决定型动物的性别是在其胚胎发育的温度敏感期(龟多数在15～17期)内由温度决定的，因此，其胚胎发育时相的准确划分(特别是14时相以后)对于其性别调控非常重要。胚胎发育时相的划分方法通常是通过定期解剖观察来确定的。通过受精卵外观观察与解剖观察，获得了相关性很强的数据。国际上普遍采用Yntema【1】的分期标准(分为26期)进行龟胚胎发育时相的划分，朱新平报道了黄喉拟水龟的胚胎发育(分为22期)。国内外关于黄喉拟水龟的发明专利已有一些报道，主要涉及黄喉拟水龟孵化方法【2】、黄喉微卫星标记及其应用【3】、拟水龟疾病防止方法【4】及其饲养和饲料配制方法等【5-7】。至今未见到有关通过受精卵外观判断龟鳖胚胎发育时相的报道。参考文献：【1】YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251.【2】朱新平，魏成清等。2007.黄喉拟水龟孵化方法。发明申请号：200510121367.X.申请公布号：CN1799346A，公布日期：2007.07.12。【3】郑荣泉，章芸等。2010.一种黄喉拟水龟微卫星标记及其用途。发明申请号：201010153551.3.申请公布号：CN101880659A，公布日期：2010.11.10。【4】赵阳。2015.一种黄喉拟水龟疾病防止方法。发明申请号：201410625354.申请公布号：CN104365550A，公布日期：2015.02.25。【5】赵阳。2015.一种黄喉拟水龟的饲养方法。发明申请号：201410625352.申请公布号：CN104365549A，公布日期：2015.02.25。【6】赵阳。2015.一种黄喉拟水龟的饲料及其制备方法。发明申请号：201410625268.申请公布号：CN104397390A，公布日期：2015.03.11。【7】余珍青。2015.一种家庭饲养黄喉拟水龟的方法。发明申请号：201410626494.4.申请公布号：CN104430154A，公布日期：2015.03.25。【8】雷思佳，叶世洲。2015.一种可获得一种可获得高孵化率的三线闭壳龟雄龟苗的孵化方法。发明申请号：2014010150121.4，申请公布号：CN103875602B，公布日期：2015.09.16。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可无需解剖判断黄喉拟水龟胚胎发育时相的方法。本发明包括以下步骤：1)在黄喉拟水龟孵化季节，采集黄喉拟水龟受精卵进行孵化；2)在整个孵化过程中观察受精斑的变化情况，通过光照观察血丝的变化情况并拍照记录,孵化第一周时相变化很快且胚胎太小无法对其肉眼观察进行准确判断，因而，孵化第一周并未进行胚胎解剖观察，从孵化第8天开始每天取4～6枚受精卵观察外观随后解剖，在立体显微镜下观察胚胎发育情况，进行文字描述并拍照记录，按黄喉拟水龟胚胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分。在步骤1)中，所述孵化采用的孵化装置包含聚乙烯塑料盆和孵化介质，受精卵的动物极向上平放在孵化介质上，孵化介质的湿度控制在5％～7％；将孵化装置置于可控温、控湿的孵化室内，孵化室的相对湿度保持在65％～88％，孵化温度控制在26～33℃，具体孵化过程可参见中国专利2014010150121.4。在步骤2)中，所述按黄喉拟水龟胚胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分可参考文献(YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)。本发明涵盖黄喉拟水龟胚胎发育敏感期开始前的直到胚胎发育结束的整个过程。本发明具有以下技术效果：(1)首次参考国际通用的龟胚胎发育时相标准确定了黄喉拟水龟胚胎发育时相，使得从事温度性别决定型龟鳖类性别分化与调控的研究结果具有可比性，为龟鳖性别分化比较研究奠定基础；(2)解决黄喉拟水龟胚胎发育时相的准确判断问题，特别是无需解剖受精卵，仅通过外观观察确定其胚胎发育时相；(3)为提高黄喉拟水龟性别调控技术奠定了基础；对于生产企业而言，为普通生产者成功进行黄喉拟水龟定性育种奠定了坚实的基础。本发明在于无需解剖受精卵，通过受精卵外观观察可以得到黄喉拟水龟温度敏感期开始前到胚胎发育结束整个过程的准确的发育时相。本发明首次提出通过外观观察确定黄喉拟水龟胚胎发育时相划分的方法，首次参考国际通用的龟胚胎发育时相划分标准对黄喉拟水龟的胚胎发育进行划分，特别是给出了黄喉拟水龟温度敏感期开始前直到胚胎发育结束整个过程黄喉拟水龟受精卵外观形态特征。该发明可以准确定位黄喉拟水龟胚胎发育时相，为后期进行黄喉拟水龟性别调控研究和操作提供了有力支撑。本发明首次按照国际通用的Yntema(参考文献：YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)标准对黄喉拟水龟温度敏感期开始以前至胚胎发育结束期间胚胎发育时相进行了系统描述,运用本发明进行黄喉拟水龟胚胎发育时相判断的主要优点在于：参照国际通用的龟胚胎发育时相划分标准(共计26期)对黄喉拟水龟的时相进行划分，使得黄喉拟水龟性别分化及性别调控研究学者的研究工作具有可比性。由于可以通过外观形态对黄喉拟水龟的发育时相进行判断，减少了研究过程中解剖动物进行判断的工作量，大大提高工作效率。而对于养殖企业而言，技术人员无需通过解剖、解剖镜下观察，无需高端仪器设备，仅仅通过手电筒就可以准确进行发育时相的判断，大大提高了黄喉拟水龟性别调控的可操作性和操作的成功率。附图说明图1为图版Ⅰ。在图1中，(1)受精卵表面观，(2)胚胎左侧面观，(3)胚胎右侧面观。12：孵化11天；13：孵化13天；14：孵化15天；15：孵化17天；16：孵化19天；17：孵化21天。图2为图版II。在图2中，(1)受精卵表面观，(2)胚胎左侧面观，(3)胚胎右侧面观。18：孵化23天；19：孵化26天；20：孵化29天；21：孵化32天；22：孵化36天；22：孵化40天。图3为图版III。在图3中，(1)受精卵表面观，(2)胚胎左侧面观，(3)胚胎右侧面观。24：孵化47天；25：孵化54天；26：孵化60天。具体实施方式实施例1：在黄喉拟水龟产卵季节(5～7月)采集黄喉拟水龟受精卵150枚进行孵化，孵化方法(参见中国专利：2014010150121.4)。孵化装置包含聚乙烯塑料盆和恒温恒湿箱，受精卵的动物极向上平放在孵化介质上，受精卵间距保持在1.2cm左右，将孵化用聚乙烯塑料盆置于可控温、控湿的孵化室内(恒温恒湿箱)，孵化室的相对湿度保持在65％～88％之间，孵化温度控制在29±0.1℃。孵化初期，孵化室的相对湿度控制在65％，孵化中期相对湿度上调至75％，孵化后期相对湿度控制在85％～88％。在整个孵化过程中观察受精斑的变化情况，用手电筒光照受精卵观察胚胎血丝的变化情况并拍照记录。从孵化第8天开始每天取受精卵4～6枚进行外观观察，随后解剖在立体显微镜下观察胚胎发育情况，进行文字描述并拍照记录，参考Yntema(参考文献：YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)的描述的龟胚胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分。本发明涵盖黄喉拟水龟胚胎发敏感期开始前的第12期直到胚胎发育结束的26期，整个孵化过程持续60天。29℃下胚胎发育时相列于表1。实施例2：在黄喉拟水龟产卵季节(5～7月)采集其受精卵150枚进行孵化，孵化方法参见中国专利：2014010150121.4。孵化装置包含聚乙烯塑料盆和恒温恒湿箱，受精卵的动物极向上平放在孵化介质上，受精卵间距保持在1.2cm左右，将孵化用聚乙烯塑料盆置于可控温、控湿的孵化室内(恒温恒湿箱)，孵化室的相对湿度保持在65％～88％之间，孵化温度控制在27±0.1℃。孵化初期，孵化室的相对湿度控制在65％，孵化中期相对湿度上调至75％，孵化后期相对湿度控制在85％～88％。在整个孵化过程中观察受精斑的变化情况，用手电筒光照受精卵观察胚胎血丝的变化情况并拍照记录。从孵化第8天开始每天取受精卵4～6枚进行外观观察，随后解剖在立体显微镜下观察胚胎发育情况，进行文字描述并拍照记录，参考Yntema(参考文献：YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)的描述的龟胚胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分。本发明涵盖黄喉拟水龟胚胎发敏感期开始前的第11期直到胚胎发育结束的26期，整个孵化过程持续78天，27℃下胚胎发育时相列于表1。实施例3：在黄喉拟水龟产卵季节(5-7月)采集其受精卵150枚进行孵化，孵化方法参见中国专利：2014010150121.4。孵化装置包含聚乙烯塑料盆和恒温恒湿箱，受精卵的动物极向上平放在孵化介质上，受精卵间距保持在1.2cm左右，将孵化用聚乙烯塑料盆置于可控温、控湿的孵化室内(恒温恒湿箱)，孵化室的相对湿度保持在65％～88％之间，孵化温度控制在27±0.1℃。孵化初期，孵化室的相对湿度控制在65％，孵化中期相对湿度上调至75％，孵化后期相对湿度控制在85％～88％。孵化温度控制在32±0.1℃。孵化初期，孵化室的相对湿度控制在65％，孵化中期相对湿度上调至75％，孵化后期相对湿度控制在85％～88％。在整个孵化过程中观察受精斑的变化情况，用手电筒光照受精卵观察胚胎血丝的变化情况并拍照记录。从孵化第11天开始每天取受精卵4～6枚进行外观观察，随后解剖在立体显微镜下观察胚胎发育情况，进行文字描述并拍照记录，参考Yntema(参考文献：YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)的描述的龟胚胎发育时相的划分标准对中华鳖的胚胎发育时相进行划分。表1时相29℃27℃32℃121114101313171214152014151722161619251817212820182330221926342520293828213242302236473423405238244761452554705126607857本发明涵盖黄喉拟水龟胚胎发敏感期开始前的第12期直到胚胎发育结束26期，整个孵化过程持续54天，32℃下胚胎发育时相列于表1。所述黄喉拟水龟胚胎发育时相的具体划分方法如下：根据国际通用的龟时相划分标准(参考文献：YntemaC.AseriesofstagesintheembryonicdevelopmentofChelydraserpentine[J].JournalofMorphology,1968,125:219-251)的划分方法对黄喉拟水龟的时相发育做了重新定义。根据受精卵外观、胚胎日龄及胚胎形态特征变化将整个胚胎发育过程分为26期，主要以头部、四肢、背甲及腹甲的变化作为分期依据。以下结果是受精卵在29℃孵化温度下的发育过程。第十二期(29℃，第11天，图版Ⅰ-12)受精卵外观：受精斑包围受精卵约1/2，光照下血丝环大而明显，胚体横躺于卵黄之上，眼睛隐约可见胚体外观：身体出现弯曲，尾部轻微卷曲，头部较小，眼睛色素较明显，四肢肢芽明显，心脏突出体外，几乎透明，跳动明显，后肢之间的尿囊布满血丝第十三期(29℃，第13天，图版Ⅰ-13)受精卵外观：受精斑包围受精卵约1/2，光照下血丝环大而明显，胚体横躺于卵黄之上，眼睛隐约可见。胚体外观：身体出现弯曲，尾部轻微卷曲，头部较小，眼睛色素较明显，四肢肢芽明显，心脏突出体外，几乎透明，跳动明显，后肢之间的尿囊布满血丝第十四期(29℃，第15天，图版Ⅰ-14)受精卵外观：受精斑包围受精卵超过1/2，胚体上方可见两簇较细的血丝簇。胚体外观：头部较大，眼睛黑亮，仅余一条较细的白色缝隙心脏跳动可见，指板形成，躯干侧面开始出现背甲界限第十五期(29℃，第17天，图版Ⅰ-15)受精卵外观：受精斑变化情况不再明显，胚体上方血丝簇明显且加粗.胚体外观：眼睛黑亮，大而突出，指板明显，四周平滑，背甲形成，肠道穿过体壁突出体外。第十六期(29℃，第19天，图版Ⅰ-16)受精卵外观：胚体上方血丝簇更加明显加粗且增多。胚体外观：眼睛完全黑亮，白色缝隙消失，大而突出，指板出现轻微的指间凹槽，下颚末端到达晶状体水平，背甲变宽大且出现极轻微的盾片轮廓，腹甲雏形出现。第十七期(29℃，第21天，图版Ⅰ-17)受精卵外观：胚体可见，眼睛隐约可见，血丝明显延长加粗包围胚体。胚体外观：眼睛完全黑亮，大而突出，下颚末端延伸超出晶状体水平，吻突开始出现，指板周围出现明显的锯齿状突起，背甲出现轻微的盾片轮廓，腹甲明显，一定程度上遮挡了心跳情况，但心跳仍可见。第十八期(29℃，第23天，图版II-18)受精卵外观：胚体明显可见，且颜色更深，血丝粗大，在光照下，卵内整体较通红，卵内上部开始出现空白部分。胚体外观：眼睛增大且突出明显，眼睑出现，下颚末端超出眼睛前端水平，吻突出现，背甲变宽大，以至于胚体不能完全侧躺，腹甲明显但还未见腹甲盾片分界，心跳仍可见，指板四周锯齿状突起深而明显，背甲盾片轮廓更清晰，尾部末端不再朝腹部卷曲。第十九期(29℃，第26天，图版II-19)受精卵外观：胚体明显可见，血丝逐渐明显覆盖整个卵黄，在光照下，卵内整体更为通红，卵内上部空白部分在垂直面上约占1/3。胚体外观：下眼睑明显，但还未到达晶状体水平，鼻突明显，鼻中隔色素增多，吻突明显呈亮白色，颈部背面以及背甲有明显色素沉积，脊柱明显，背甲肋骨清晰可见，背甲盾片清晰可见，前肢五指分开，后肢四指分开，腹甲发育良好几乎完全遮盖住心脏跳动情况，尾部细长，其末端不再朝腹部卷曲，可摆动。第二十期(29℃，第29天，图版II-20)受精卵外观：胚体明显可见，血丝粗大并明显覆盖整个卵黄，在光照下，卵内整体通红，卵内上部空白部分在垂直面上约占1/3胚体外观：下眼睑到达晶状体的下边缘，背甲盾片界限非常明显，色素进一步加深，三条棱轻微可见，背甲明显变大，腹甲有轻微色素沉积，四肢背部皮肤鳞片明显，足趾部分开始出现爪子，前肢靠近背部的两趾有明显色素沉积，四肢可摆动，头部轻微摆动但还未见收缩第二十一期(29℃，第32天，图版II-21)受精卵外观：胚体明显可见，血丝粗大并明显覆盖整个卵黄，在光照下，卵内上部空白部分在垂直面上超过1/3。胚体外观：胚体逐渐调转方向，开始竖躺于卵黄之上，下眼睑穿过晶状体的下边缘，背甲盾片界限非常明显，色素进一步加深，三条棱轻微可见，背甲明显变大，腹甲有少量色素沉积，四肢背部皮肤鳞片明显，五趾着色较明显，四肢摆动较灵活，头部轻微摆动但还未见收缩。第二十二期(29℃，第36天，图版II-22)受精卵外观：胚体明显可见，血丝粗大并明显覆盖整个卵黄，在光照下，卵内上部空白部分在垂直面上约占1/2胚体外观：下眼睑覆盖了大部分瞳孔，整体色素沉着增加，背甲开始骨质化，盾片变得粗糙，可见突起颗粒，腹甲色素沉着明显，甲桥可见色素，四肢背部皮肤鳞片更加粗糙呈暗灰色，爪子色素沉着明显，被包裹在半透明的爪鞘里，四肢摆动灵活，头部可自由收缩，肠道缩回体内。第二十三期(29℃，第40天，图版III-23)受精卵外观：胚体大而黑，在光照下，卵内上部空白部分在垂直面上约占1/2胚体外观：身体明显变大，上下眼睑还不能完全合拢，整体色素沉着更加明显，呈暗灰色，腹甲色素非常明显呈黑色，爪子色素下沉至趾末端，被包裹在半透明的爪鞘里，四肢更灵活摆动但还不能支撑身体，头部收缩更有力第二十四期(29℃，第47天，图版III-24)受精卵外观：胚体更大而黑，胚体周边的血丝粗大，卵内上部空白部分在垂直面上超过1/2。胚体外观：身体大小与卵黄相近，其长度基本达到最大，上下眼睑可合拢，四肢更灵活可拖地爬行，整体色素沉着近黑色，爪子整体呈黑色，仍被包在爪鞘中。第二十五期(29℃，第54天，图版III-25)受精卵外观：卵内上部全空，只余底部胚体暗黑，胚体周围的血丝明显胚体外观：卵黄大小为身体的1/2,整体特征与出壳稚龟相似，四肢有力，能支撑身体爬行。第二十六期(29℃，第54天，图版III-25)受精卵外观：卵内上部全空，只余底部胚体暗黑，胚体周围的血丝消失。胚体外观：卵黄全部被吸收，只在腹甲中央留下一个小小的缝隙，有些完全收好，背甲展平，爪鞘被磨掉。当前第1页1 2 3