石蒜花提取物的制备方法及在制备治疗或预防油茶病害药物中的用途与流程

本发明涉及石蒜花提取物的制备方法，具体地指一种石蒜花提取物的制备方法及在制备治疗或预防油茶病害药物中的用途。

背景技术：

油茶(Camellia oleifera)是我国特有的一种高级油料作物，与油棕、橄榄和椰子并称世界四大木本油料树种，请见(庄瑞林.中国油茶[M].北京：中国林业出版社，2008.)。油茶的综合价值很高，茶籽通过压榨后取得的茶油是深受群众喜爱的优质食用油，其不饱和脂肪酸含量90％以上；茶油还能通过深加工生产高级保健食用油、医药和天然化妆品用油等；茶油在工业上可制取油酸及其酯类，以此为原料生产肥皂和凡士林等，还可经极度氢化后水解制硬脂酸和甘油等工业原材料；另外，茶油还可作为医药原料制作注射用的针剂和调制各种药膏、药丸等，请见(刘跃进，欧日明，陈永忠.我国油茶产业发展现状与对策[J].林业科技开发，2007，21(4):1-4.)。因此，油茶的经济价值非常高，被广泛应用于食品、医药保健品及生物化工领域，有着广阔的国内外市场需求。

然而，油茶病害种类繁多，油茶炭疽病、叶枯病、软腐病、根腐病、茶饼病、黑斑病等在我国各油茶产区普遍发生，主要引起落果、落蕾、枝梢枯死、枝干溃疡、甚至整株死亡，每年油茶产业因病害造成了巨大的经济损失，请见(束庆龙，张良富.中国油茶栽培与病虫害防治[M].北京：中国林业出版社，2009.)。近年来，湖北油茶种植规模不断扩大，相应的病害逐步引起高度重视。

目前对油茶主要病害的防治普遍通过种植抗性品种和化学防治来控制，过多使用化学杀菌剂有危害人类身体健康、药物残留破坏生态环境、引发病原物产生抗药性、影响茶油质量和食用安全等诸多缺点，不利于油茶产业可持续发展。因此，当前防治油茶病害的首要任务是寻求安全、高效和经济的生物源农药。

国内外已有植物提取物抑制植物病害的相关报道，如张启东等采用30种药用植物提取物展开杀虫杀菌活性研究，结果表明卡瓦胡椒和厚朴的乙醇提取物对玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌、小麦根腐病菌和油菜菌核病菌具有较高的杀菌活性，请见(张启东，黄路枝，胡兆农，等.30种药用植物提取物杀虫杀菌活性研究[J].西北植物学报，2006(06)：1223-1230.)；汪晓娟等研究了百部碱等5种植物提取物对水霉菌的抑制作用，结果表明苦楝提取物对水霉菌抑制作用最为明显，请见(汪晓娟，胡青，林岗.百部碱等5种植物提取物对水霉菌的抑制作用[J].安徽农学通报(上半月刊)，2012(23)：38-42.)；周建宏等采用生长速率法初步筛选了20种植物的水提取物对油茶软腐病菌、炭疽病菌的生物活性，不同植物提取物的林间防治效果表明：当丁香、黄芩提取物及茶皂素的质量比为1:1:1时，对油茶主要病害的防治效果最好，可达80％，同时可以将油茶的病果率降低约60％，请见(周建宏，刘君昂，邓小军，等.植物提取物对油茶主要病害的抑菌作用[J].中南林业科技大学学报，2011(04)：42-45.)。周德明等研究了12种植物对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制活性，结果表明博落回的乙醇粗提物对油茶炭疽病、油茶软腐病的抑制作用最强，其室内离体抑菌率分别达80.87％和61.1％，请见(周德明，艾芹，周国英.12种植物对油茶炭疽病菌和软腐病菌的抑制活性[J].江苏农业科学，2015(06)：121-123.)。后面2则研究主要针对油茶软腐病菌和炭疽病菌，其防治范围还有进一步扩大的空间，对油茶病害的防治效果也可进一步提高。

石蒜(Lycoris radiate)是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris Herb.)草本植物，别名红花石蒜、龙爪花等，请见(李明凯，张玉琼，董召荣，等.高效液相色谱法测定石蒜中加兰他敏、力可拉敏及石蒜碱3种生物碱[J].分析测试学报，2012，31(8)：957-961.)。石蒜是东亚常见的园林观赏植物，冬赏其叶，秋赏其花；是优良宿根草本花卉，园林中常用作背阴处绿化或林下地被花卉，花镜丛植或山石间自然式栽植，现人工种植越来越多。花期过后，花瓣枯萎凋谢，不被人们利用。

技术实现要素：

本发明的目的提供了一种石蒜花提取物的制备方法，该方法利用凋谢后的石蒜花瓣制得石蒜花提取物，该方法生产简单，方便易行，适合规模化生产和实际应用。制备石蒜花提取物的原料来自于凋谢的石蒜花瓣，生产成本极低，变废为宝。

本发明的第二个目的是提供了石蒜花提取物在制备治疗或预防油茶主要病害药物中的应用，该石蒜花提取物作为防治油茶主要病害的生物源杀菌剂，其高效防治油茶炭疽病、叶斑病、黑斑病和溃疡病，提取物抑菌率实验表明，该石蒜花提取物对油茶主要病害的抑菌率达到90％以上。

为实现上述目的，本发明提供的一种石蒜花提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)采集已经枯萎或者凋谢的石蒜花瓣，清洗干净后晾干，

2)将清洗晾干后的花瓣样品匀浆粉碎，

3)将花瓣与提取溶剂按质量体积比1:10～30g/L混合，，浸提24～72h，过滤花瓣杂质后即可得到石蒜花提取物，其中，提取溶剂为质量分数为60～90％的乙醇溶液。

进一步地，所述步骤3)中，乙醇溶液的质量分数为70～85％。

再进一步地，所述花瓣与乙醇质量体积比1:15～25g/L。

本发明还提供了一种上述制备得到石蒜花提取物在制备治疗或预防油茶病害药物中的应用，所述油茶病害为油茶炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病或油茶溃疡病。其应用基本过程是：

A、采用滤纸片平板对峙培养法研究石蒜花提取物对油茶主要病害的拮抗作用。准备好直径为7mm的滤纸片并灭菌处理，并在石蒜花提取物中浸润2min；将打好的直径为7mm的病原菌饼和浸润后的滤纸片放置在平板中心线上，病原菌饼置于平板中央，浸润有石蒜花提取物的滤纸片分别距离平板中心1.5cm，置于28℃恒温培养箱培养，并每隔24h在超净工作台中无菌吸取5μL石蒜花提取物浸润1个滤纸片，5～7天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100％。

B、采用培养法研究石蒜花提取物对油茶主要病害的拮抗作用。将石蒜花提取物与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理重复3次。5天后测量病原菌菌落直径。

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100％。

本发明的有益效果在于：

1)本发明首次发现了石蒜花提取物对油茶主要病害(如油茶炭疽病、油茶胶孢炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病、油茶溃疡病等)均具有较强的抑制和灭杀活性。抗菌谱广泛，可有效降低防治成本。

2)石蒜花花期过后，花瓣枯萎凋谢，不被人们利用。本发明则利用凋谢后的石蒜花瓣制得一种石蒜花提取物，原料成本极低，变废为宝。

3)本发明的石蒜花提取物制备方法简单，效果明显，弥补了一般化学药剂和生物农药防效不显著的缺陷，更易在实际生产中得到应用。

4)本发明制备的石蒜花提取物杀菌活性成分多样，可缓解油茶病害致病菌的耐药性产生，且植物活性成分易代谢，在土壤中无残留，因此，该生物药剂产品能长期在某个地区使用，施用后对人畜无毒害，环境友好。

5)本发明利用培养法实验抑菌率表明：该石蒜花提取物对油茶主要病害的抑菌率达到90％以上。

附图说明

图1为时间对石蒜花提取物对油茶胶孢炭疽病拮抗效果的影响示意图。

图2为温度对石蒜花提取物对油茶胶孢炭疽病拮抗效果的影响示意图。

图3为石蒜花提取物对油茶黑斑病原菌的拮抗效果示意图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

本发明所用的试剂或原料，均购自商业渠道。

菌株来源：油茶炭疽病Colletotrichum nicotianae同文献中报道菌株(李东升，张一扬.烟草炭疽病的形态特征和致病性研究[J].湖南农业科学，2009(5)：97-98.)；油茶胶胞炭疽病Colletotrichum.gloeosporioides，同文献中报道菌株(孟庆敏，周国英，刘君昂，等.油茶炭疽病拮抗细菌Y13主要抑菌物质分离纯化及作用方式[J].植物保护，2014，40(2)：36-42.)；油茶叶斑病Phyllosticta capitalensis，同文献中报道菌株(马成,彭丽娟,吴石平.银杏叶点霉叶斑病病原菌鉴定[J].贵州农业科学,2014,42(12):126-128.)；油茶软腐病Agaricodochium camellia，同文献中报道菌株(赵丹阳,秦长生,廖仿炎.5种杀菌剂对油茶软腐病的防治研究[J].广东林业科技,2013,29(2):28-31.)；油茶黑斑病Altermaria alternate同文献中报道菌株(Kobiler I,Akerman M,Huberman L,et al.采前与采后处理结合控制柿子贮藏过程中链格孢菌(Alternaria alternata)引起的黑斑病的研究[J].保鲜与加工,2011,5:025.)，油茶溃疡病Bothyosphaeria dothidea，同文献中报道菌株(Slippers B,Crous P W,Denman S,et al.Combined multiple gene genealogies and phenotypic characters differentiate several species previously identified as Botryosphaeria dothidea[J].Mycologia,2004,96(1):83-101.)。

实施例1

石蒜花提取物1的制备方法，其步骤是：

1)采集已经枯萎或者凋谢的石蒜花瓣，自来水清洗干净后晾干，

2)利用匀浆机将清洗晾干后的花瓣样品匀浆粉碎，按照质量体积比1：10g/L将花瓣和质量分数为90％的乙醇溶液混合，浸提24h，过滤花瓣杂质后即得到石蒜花提取物1，4℃短期保藏。

实施例2

石蒜花提取物2的制备方法，其步骤是：

1)采集已经枯萎或者凋谢的石蒜花瓣，自来水清洗干净后晾干，

2)利用匀浆机将清洗晾干后的花瓣样品粉碎，按照质量体积比1：20g/L将花瓣和质量分数为60％的乙醇溶液混合，浸提72h，过滤花瓣杂质后即得到石蒜花提取物2，4℃短期保藏。

实施例3

石蒜花提取物3的制备方法，其步骤是：

1)采集已经枯萎或者凋谢的石蒜花瓣，自来水清洗干净后晾干，

2)利用匀浆机将清洗晾干后的花瓣样品粉碎，按照质量体积比1：15g/L将花瓣和质量分数为80％的乙醇溶液混合，浸提48h，过滤花瓣杂质后即得到石蒜花提取物3，4℃短期保藏。

实施例4

一种石蒜花提取物在制备治疗或预防六种油茶病原菌药物中的应用，其步骤是：

A.蒜花提取物与多种油茶病原菌体外互作：采用平板对峙培养法：准备好直径为7mm的滤纸片并灭菌处理，并在石蒜花提取物中浸润2min；将打好的直径为7mm的病原菌饼和浸润后的滤纸片放置在平板中心线上，病原菌饼置于平板中央，浸润有石蒜花提取物的滤纸片分别距离平板中心1.5cm，置于28℃恒温培养箱培养，并每隔24h在超净工作台中无菌吸取5μL石蒜花提取物浸润1个滤纸片，5-7天后观察抑菌带有无及大小，每个处理重复3次。结果见表1。

结果表明石蒜花提取物对油茶炭疽病、胶孢炭疽病、叶斑病、软腐病、黑斑病和溃疡病均有很好的拮抗作用，抑菌率均达到90％以上。

表1石蒜花提取物对油茶主要病害的抑菌率

表中数据为平均值±标准差(下同)，

抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100％。

B、采用培养法。将石蒜花提取物与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7mm的油茶主要病原菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理重复3次。5天后测量病原菌菌落直径。

抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100％。

表2同样显示石蒜花提取物对油茶主要病害的抑菌率均达到90％以上，尤其是对黑斑病的抑菌率达到99.6％，如图3所示，系列结果表明石蒜花提取物抗菌谱广，抑菌效果显著。A中培养基未添加石蒜花提取物，病原菌生长快速，菌落直径达到62.8±0.8mm，而B中培养基添加石蒜花提取物后，几乎完全抑制了病原菌的生长，抑菌效果显著。

表2石蒜花提取物对油茶主要病害的抑菌率

实施例3

石蒜花提取物在制备治疗或预防马铃薯干腐病和睡莲黑斑病病原菌药物中的应用，采用培养法步骤是：

将石蒜花提取物与约50℃的PDA固体培养基按照1:19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央分别放入直径为7mm的马铃薯干腐病和睡莲黑斑病菌饼，以无菌水为对照，每个处理重复3次。5天后测量病原菌菌落直径。抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)×100％。表3显示石蒜花提取物对马铃薯干腐病和睡莲黑斑病原菌的抑菌率超过50％，该提取物的抑菌谱较广。

表3石蒜花提取物对玛咖根腐病和睡莲黑斑病病原菌的抑菌率

实施例4

石蒜花提取物抗菌物质稳定性测试

时间稳定性测试：按照提取方法制备好石蒜花提取液，分别在4℃下放置0d、10d、20d、30d、40d、50d、60d测试其对油茶胶胞炭疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每个处理重复3次。对油茶炭胶胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如图1所示。结果显示该提取物对油茶胶孢炭疽病拮抗效果随时间的增加而减弱，且在40天范围内略微降低，第60天后，抑菌活性降低幅度变大，说明该提取物中有效成分能保留较长时间，但最好在该提取物活性较强的期限40天内使用。

温度稳定性测试：按照提取方法制备好石蒜花提取液，各取5mL转入无菌试管中，分别在温度为20℃、40℃、60℃、80℃、100℃下处理2h，测试其对油茶炭胶胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的抑制作用。每个处理重复3次。对油茶炭胶胞疽病菌(Colletotrichum.gloeosporioides)的拮抗效果如图2所示。结果表明该石蒜花提取物在40℃时拮抗效果最佳，且在当温度高于80℃时，抑菌活性逐渐降低，说明该提取物中有效成分部分耐高温能力较强，部分有效成分不能耐高温。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。