一种玉米与高粱杂交的方法与流程

本发明属于远缘杂交育种技术领域，尤其涉及一种玉米与高粱杂交的方法。

背景技术：

在作物改良中,常利用植物属间的远缘杂交,将异种植物的有用性状向栽培种转移。植物远缘杂交的难易程度一般由两亲本亲缘关系的远近所决定。目前玉米已经与野生二倍体大刍草、薏米、摩擦禾、水稻等作物通过常规手段已经进行了杂交并得到了相关的材料。吉林省农科院利用花粉管通道法的方法把高粱基因组导入到玉米植株中得到一批新的种质资源，并未使用简单的传统授粉方法。

1985年Bernard等进行玉米与高粱杂交没有成功。现有技术只是进行了花粉管通道法的转基因方法的杂交，没有进行传统的远缘杂交授粉。到目前为止，未见报道玉米与高粱通过常规授粉杂交成功的案例。现有技术没有做成功主要可能和所用的亲本材料的基因型、授粉方式、授粉前处理、授粉时间等因素有直接的关系。现有技术只是使用任意玉米材料和高粱材料杂交，没有选择到合适的基因型，同时现有技术只是直接授粉，没有经过预处理和授粉时间的选择。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米与高粱杂交的方法，旨在解决现有技术只是使用任意玉米材料和高粱材料杂交，没有选择到合适的基因型，同时现有技术只是直接授粉，没有经过预处理和授粉时间的选择的问题。本发明拟通过该技术手段解决玉米与高粱授粉的结实问题，提高玉米结实率。

本发明是这样实现的，一种玉米与高粱杂交的方法，所述玉米与高粱杂交的方法通过对玉米母本授粉前处理和授粉两道程序获得杂交种质；通过表型和分子鉴定技术对杂交后代进行鉴定，确定为真杂种；

具体包括：授粉前取玉米花粉，放入研钵中，加入去离子水，去离子水加入量是花粉的3倍，摇研磨10分钟～30分钟，然后倒入试管中，用干净毛刷把研磨液体刷到花丝上；

授粉：花丝涂抹2小时～12小时后，取父本高粱花粉，把高粱花粉授予处理过花丝的玉米雌穗上。

进一步，所述玉米母本为wysc7亲本材料；父本高粱花粉为s332。

进一步，对授粉后的处理过花丝的玉米雌穗和未处理的雌穗分别挂牌标记。

本发明另一目的在于提供一种上述玉米与高粱杂交的方法获得的真杂种及其后代。

本发明解决了玉米与高粱杂交结实性不好的问题，使结实穗数提高了4倍，结实粒数提高了321倍(表1)，达到了高粱抗逆基因导入玉米中的目的(如附图2、3)。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)至今尚未有玉米与高粱杂交成功的报道，通过授粉前处理可以获得大量后代；(2)通过表型分析和分子鉴定技术对杂交后代进行了鉴定，利用1个标记(5号)对23个F1单株进行鉴定，有14个单株有高粱基因组片段，14个单株被确定为真杂种，比例达到60.87％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的玉米与高粱杂交的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的利用26对SSR标记筛选母本和父本，得到只在父本(高粱)基因组上能扩增出的标记12对图。

图3是本发明实施例提供的用5号标记扩增23个F1植株，14个单株可以扩增出产物，其它单株没有扩增出结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的玉米与高粱杂交的方法，包括：

S101：授粉前处理：在授粉前取玉米(wysc7)花粉，放入研钵中，加入去离子水，去离子水加入量是花粉的3倍，摇研磨10-30分钟，然后倒入试管中，用干净毛刷把研磨液体刷到花丝上(保证不能窜粉)。

S102：授粉：花丝涂抹2-12小时后，取高粱花粉，把高粱(S332)花粉授予处理过花丝的玉米雌穗上，分别授粉100穗，分别挂牌标记。

下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步描述。

本发明基因型选择：由于本发明使用的材料直接预处理，没有进行选择。由于育种材料的更新，现有的材料更加适合远源杂交，前人没有做成功可能是由于基因型不合适。

本发明授粉前预处理：授粉成功的第一步是要形成花粉管，远缘杂交成功率低主要是没有形成花粉管，所以玉米花粉中有一种酶或者什么物质促进花粉管的形成，为了使花粉失去活力，本发明使用水使花粉失去活力不能受精成功，通过研磨促进花粉中的酶或的其它促进花粉管的物质外渗，然后涂抹花丝，形成花粉管(没有观察花粉管形成)。

本发明的授粉时间，由于涂抹花丝后花丝带水，如果这时授粉可能使高粱花粉破裂失活，所以本发明选择2-12小时，在该时段授粉结实较高，超过12小时显著降低。

本发明所用的亲本材料母本是玉米wysc7，父本高粱s332，均来自***农业科学院生物技术研究中心。

经过玉米和高粱授粉后，不同处理间的玉米结实情况差异显著。授粉前未处理的结实穗数为25个(25％)，结实总粒数是38粒种子，处理后结实穗数是100个(100％)，结实总粒数是12216粒种子(表1)。对结实的F1代种子于2016年5月种植于**********实验基地，通过与父母本表型比较，F2代群体表现出显著的表型分离，可以发现杂交成功。

表1不同处理下100穗玉米与高粱杂交授粉结实情况统计

实施例2.

玉米与高粱基因组重组验证

选取26对高粱特异SSR分子标记(表2)，筛选wys7和S332的基因组DNA，选取只是在S233中能扩增出的标记作为F1中鉴定标记。DNA提取采用CTAB法。PCR反应体系见表3。

表2所用高粱SSR分子标记引物序列

表3.PCR扩增反应体系浓度及物品用量表

利用26对SSR标记筛选母本和父本，得到只在父本(高粱)基因组上能扩增出的标记12对(图2)。用5号标记扩增23个F1植株，14个单株都可以扩增出产物，其它单株没有扩增出结果(图3)，表明高粱的DNA片段成功导入玉米基因组中

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 山西省农业科学院生物技术研究中心 ；江苏省农业科学院

<120> 一种玉米与高粱杂交的方法

<160> 26

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GACTATAGACAGATCCGGGC CTCAATAAAGTCGGCTCCAC

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TCGCTATCCTCACCTATCAA ATGGTTCTTGCTACTCCCAG

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CACACAGTCGAGAGCAAAAC TGATCACTTTCGTGATCGAG

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GCTAGCAATCAGGTCTTGGT AGAGATGTTTGGTTGGTGGT

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TCTAGGCATTTATAAGCCCG CACGTGAGGTCCACATTTTA

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CTACACCAGTATGCAAAGGC ATGCTAGGTCTAGCTGCCTG

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

ACCGATATCCTGAAATGTCC TGCTGACCAATCACTTCTGT

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TCTCTAGCTAGCGCACACAC CATCCATAAGGGAGAGTTCG

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

AACACATGTGCTCAATGCTC CACATTTCTTCCCAGTAGCC

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CCTGAGCAAAGGCAGTATTT ATATGTATGGTCCCGTCCAC

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GTCGATGTGTGTGACCGTAT CTTTCCTCCTTGTTGTTCGT

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

AGTACCGTATGGTGATGCG GGCGATCGTGGAGTAGTAGT

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CCGATGTTGATGGAAGAGAT TAGTCAAACACAATGTCCGC

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GATCGCTCTCTCTCGTTTTT TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GTGTGTGTGTCTGTCTCGCT GAGGGAGAGAGAGAGGGCT

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TAAGAGAATCACACCTGGCA GCTGTTCACTTTTCCTCGTT

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GAGAACAATAACGCGTGGA GAAATGGGCATATGAGATGG

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CTGCTGCTGCTTTCTCAATA TGCATCATATCCTGATGGAG

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GACACACAGAGACCCAGACA GTCTCTCTCTCTCTCCCGCT

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GTGATCCGAACCTAGCAGAT GGATAGATTTTGGTTGGACG

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

AGCTTATCGATACCGTCCTG CTGTGAGACAAGACTGTCGG

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

GGTCTGGTAGAGGTTCATGG ATCCGGTAAGGTAGACCCTC

<210> 23

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TATTTCACAGGGGAATCAGG TCCATTGTACTTTTAGCCCC

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CTACGACGTACAGGCAGTTG TACCGCCTGATCTCTTCACT

<210> 25

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

CCTCACTATAGGGCGAATTG CAGGGTTCTTATCGCATACC

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列

<400>高粱SSR分子标记引物序列

TTGGCACATGCATATACTCC ACGGCATGTCGATAAGTGTA。