本发明涉及植物生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种提高罗汉果中赛门苷I含量的方法。
背景技术：
罗汉果(Siraitia grosvenorii)为中国特有的珍贵药用和甜料植物。其果实性凉、味甘，具有清热润肺，利咽开音，滑肠通便和抗癌等功效。研究表明，罗汉果赛门苷I是目前发现的世界上最强的非糖甜味物质，在万分之一浓度时为5％蔗糖甜度的563倍，是糖尿病人、肥胖者和高血压患者的理想糖替代品。然而，赛门苷I只存在占果重不足15％的果肉内，且含量极为低下，以致价格昂贵，大大限制了其在食品、保健品和药品中的广泛应用，严重制约了罗汉果产业的健康发展。
茉莉酸甲酯广泛地存在于植物体中，外源应用能够激发防御植物基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果。现有技术中未见有茉莉酸甲酯提高罗汉果中赛门苷I含量的报道。
技术实现要素：
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，其能够有效地提高罗汉果赛门苷I的产量，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，以满足罗汉果赛门苷I的大规模生产，具有较强的实用性和推广价值。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，在罗汉果组培过程或栽培过程中施加茉莉酸甲酯。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，组培过程中，将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，栽培过程中，将茉莉酸甲酯配成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，包括：
步骤一、将罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28～31d，其中，茉莉酸甲酯的添加量为50～400μmol/L；
步骤二、将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20～30d后，每天喷洒浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8～12d。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50～400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50～400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，MS固体培养基还包括调节剂，调节剂的添加量为5μmol/L，调节剂包括质量比为2:1:0.1的竹醋液、百部水提物、槲皮素。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3～5d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5～7d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液。
优选的是，所述的提高罗汉果中赛门苷I含量的方法，授粉后将植株的顶部环割多个环形切口，相邻两个切口间距5mm，每天先喷洒质量分数为1％的黄酮素溶液、然后用桃胶涂抹切口、最后用鱼腥草绑缚切口，直至开始喷洒茉莉酸甲酯溶液。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明通过在组培和/或栽培过程施加茉莉酸甲酯，能够诱导罗汉果赛门苷I代谢关键酶(如葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶等)基因的高表达，从而在短期内快速提高罗汉果赛门苷I的含量；组培过程或栽培过程优选茉莉酸甲酯的施加浓度和施用时间，将组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，或将茉莉酸甲酯溶液喷洒于授粉20～30d后的罗汉果表面，促进苗木中罗汉果赛门苷I的积累，可以最大限度地提高药用植物活性成分的含量；
第二、本发明通过在MS固体培养基中加入由竹醋液、百部水提物、槲皮素复配的调节剂，辅助促进对葡萄糖基转移酶和细胞色素P450酶防御蛋白的活性水平，实现次生物质的积累，百部水提物还具有杀虫作用，槲皮素提高调节剂在罗汉果组培苗的附着力，竹醋液促进罗汉果组培苗生长，浓度配比避免香豆素沉淀；
第三、两阶段分别不同时间间隔更换培养基，补充罗汉果生长不同阶段因消耗而所需的营养物质，第一阶段浸泡海绵避免使用过的培养基营养物质浪费，同时覆盖在上方具有保水作用、营养物质下沉吸收，第二阶段利用酪蛋白溶液雾化处理，避免组培苗叶片表面营养物质的流失，促进根部对培养基中茉莉酸甲酯的吸收；
第四、栽培阶段授粉后环割，暂时阻碍有机物质向下输送，增加伤口上部养分积累，喷洒黄酮素溶液抑制生物酶的渗出，桃胶涂抹切口利于伤口自愈，鱼腥草绑缚切口杀菌驱虫，形成防御结构，促进后期对茉莉酸甲酯的吸收。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d，然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<实施例2>
用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，罗汉果授粉25d后，每天喷洒茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例3>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为50μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养28d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉20d后，每天喷洒浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施8d。
<实施例4>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为400μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养31d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉30d后，每天喷洒浓度为400μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施12d。
<实施例5>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，至茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<实施例6>
步骤一、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200mmol/L茉莉酸甲酯的乙醇母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯的乙醇母液添加到MS固体培养基中，将调节剂加入MS固体培养基，调节剂的添加量为5μmol/L，茉莉酸甲酯的添加量为200μmol/L，灭菌并冷却至24～26℃，调节剂包括质量比为2:1:0.1的竹醋液、百部水提物、槲皮素，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；
步骤二、将罗汉果组培苗接种在步骤一得到的含有茉莉酸甲酯的MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；组培过程包括两阶段，第一阶段培养15d，每隔3d更换一次MS固体培养基，被更换的MS固体培养基加热至熔化为液态混合物，将海绵浸泡在液态混合物中充分吸收，然后覆盖在更换的MS固体培养基上方，直至下次更换培养基时移除并更换；第二阶段培养15d，每隔5d更换一次MS固体培养基，每次更换后的第2d对接种有组培苗的MS固体培养基进行雾化处理，雾化剂为质量分数为1％的酪蛋白溶液；
步骤三、用体积分数为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液，将步骤一培养后的组培苗移栽至田间，罗汉果授粉后将植株的顶部环割多个环形切口，相邻两个切口间距5mm，每天先喷洒质量分数为1％的黄酮素溶液、然后用桃胶涂抹切口、最后用鱼腥草绑缚切口，罗汉果授粉25d后，每天喷洒浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液于罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施10d。
<对比例1>
将罗汉果种子浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行浸种处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例2>
将罗汉果外植体浸泡在浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯溶液中进行预处理，然后进行常规组织培养得到组培苗，最后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<对比例3>
将罗汉果组培苗接种在MS固体培养基中，置于相对湿度60～66％、光照强度1300～1500Lux、光照时间8h/d、温度21～25℃条件下培养30d；其中，MS固体培养基包括：MS、1.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L吲哚丁酸、3.5g/L琼脂、30g/L蔗糖、以及1.0g/L活性炭；然后将组培苗移栽至田间进行常规田间培养。
<罗汉果品质试验>
对实施例2、5、6连续喷施茉莉酸甲酯溶液后的次日采样，对实施例1、对比例1～3果实发育中期授粉30d后采样，统计立枯病发病率以及罗汉果苗成活率，同时采用LC-MS法进行罗汉果赛门苷I含量检测。
液相色谱条件：色谱柱：Poroshell 120SB-C18(2.1mm×100mm,2.7μm)；柱温：30℃；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0-5min，23％B；5-15min，23％B至26％B；15-20min，26％B至33％B；20-25min，23％B)；流速：0.3mL/min；进样量0.5μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)：负离子扫描模式；选择离子监控模式(SIM)；干燥气温度：350℃；干燥气流速：9L/min；雾化气压力：176kPa；毛细管电压：3.5kV。
标准溶液的配制：准确称取罗汉果赛门苷I 10mg(精确至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至10mL容量瓶中，配制成1000mg/L标准储备液。避光4℃保存。准确移取适量的上述标准储备液，用水定容，配制成系列浓度的标准工作溶液，需现用现配。
样品处理：罗汉果样品粉碎后，准确称取0.500g于50mL锥形瓶中，加入乙醇20mL，超声(120W，40kHz)30min后取出，补重。经0.45μm的滤膜过滤后待测。
阴性样品溶液的准备：取1mL乙醇直接进样。
数据如下表所示。
由上表可知，对比例1～2相较于对比例3，赛门苷I的含量没有明显升高，说明浸种、外植体浸泡在茉莉酸甲酯溶液没有明显提升罗汉果赛门苷I的含量，实施例1、2的含量相较于对比例3，赛门苷I的含量有明显升高，说明组培或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够明显提升赛门苷I的含量，实施例5、6的含量相较于对比例3，赛门苷I的含量有显著升高，说明在组培、栽培期间均通过茉莉酸甲酯诱导植株生长，能够显著提升赛门苷I的含量。此外，实施例1、2、5、6、对比例1、2的立枯病发病率均显著低于对比例3，茉莉酸甲酯还可以显著降低罗汉果的立枯病患病率，实施例1、2、5、6的罗汉果苗成活率均高于对比例1～3，说明组培和/或栽培期间通过茉莉酸甲酯诱导植株生长能提高罗汉果苗成活率。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。