本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法，属生物
技术领域：
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背景技术：
：茶树(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科山茶属多年生常绿木本植物，茶叶是世界上三大无酒精饮料之一。近年来，随着茶产业的不断发展，茶叶生产中对优良茶树新品种的需求越来越迫切。利用生物技术进行组培快繁具有繁殖系数高，最大限度地保持品种的遗传稳定性和无性系快繁能力等优点，在茶叶生产中具有广阔的应用前景,虽然传统育种方法已培育出了产量高和品质优的茶树品种，但生产上仍缺乏高茶氨酸、高茶多酚和低咖啡碱等符合人们消费需求的优异品种。这主要是因为茶树基因的高度杂合性，传统的茶树育种年限长、难度较大。植物离体再生技术的日益成熟和基因工程技术的不断发展，为茶树品种创新开辟了新的途径。基因工程技术的应用需要建立高频率的遗传转化体系，而高频率的遗传转化体系又依赖于高频率的再生体系。茶树组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗材和人工成本。常规的茉莉花组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过药物抑菌的方法来改造培养基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够获得茶树的正常生长。然而，针对不同的植物品种要想找到一种合适的抗菌剂是比较困难的，往往是当培养基抗菌时，植物组织的生长就受到抑制；而植物组织正常生长，就无法获得满意的抗菌效果。其原因一是还没有一种抗生素对所有的菌类都有效，而且药效期短；二是有些抗菌素、防腐剂在有效的浓度下，其杀菌、抗菌离子对植物组织直接产生伤害，有些则产生盐害。必须选择与植物组织亲和、友好，药效期长(至少一个生长周期)，不产生盐害并具有杀菌、抗菌活性的物质作为抗菌剂。因此，筛选合适的抗菌药剂是开放组培技术得以应用的关键。本发明为茶树组织培养提供一种抑菌培养方法。一方面可以降低茶树组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用抑菌培养基进行茶树组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染问题，又不会对茶树生长产生毒害或抑制，即不影响茶树的正常生长，从根本上简化了茶树组织培养。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法。本发明的目的是通过以下方法实现的。本发明的一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、无菌水制备、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+1～3mg/L6-BA+0.1～1.0mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1～2mg/L6-BA+0.1～0.5mg/LIBA+0.5～2mg/LGA3+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为：1/2MS+1～3mg/LIBA+40～100mg/L次氯酸钠+5～10mg/L乳酸链球菌素+10～50mg/L丙酸钙+0.05～0.2mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；所述MS，为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌呤；所述IBA，指α-吲哚丁酸；所述GA3，指赤霉素；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：剪取无病虫害生长健壮的茶树新梢，剪去叶片后，剪成2～3cm的带腋芽茎段，用洗衣粉浸泡冲洗15min后，用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.1％升汞浸泡消毒12min，无菌水反复冲洗不少于3次；消毒后的茎段在无菌条件下接种于诱导培养基上，培养30d后长出新芽；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1000Lx；5.增殖培养：将诱导出的茶树新芽转入增殖培养基中，30d后逐步诱导出丛生芽；将丛生芽切开，或将长的新芽再切成带腋芽的茎段，接种到增殖培养基上；每30d转接一次，获得大量幼芽；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1500Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1500Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。本发明的应用效果：本发明的抑菌组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌或抑菌的作用，配制的培养基无需高温高压灭菌。因此，在茶树诱导培养、增殖培养、生根培养各个阶段，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染率的问题。1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法与常规的茶树组培方法相比，结果如表1所示，在诱导培养阶段外植体培养的成活率差异不明显。表1本发明的抑菌组培方法对茶树诱导培养的影响组培方式外植体数外植体污染数成活率(％)常规组培方法722565.3抑菌组培方法662168.22.增殖培养：本发明的抑菌组培方法与常规组培茶树的增殖倍数和污染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率二个指标都差异不显著。从瓶苗的生长状况看，本发明抑菌组培方法的培养基由于不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，其茶树组培苗更壮，叶色更绿。表2本发明的抑菌组培方法对茶树增殖倍数和污染率的影响3本发明的抑菌组培方法对茶树生根率和污染率的影响：在组培苗生根过程中，本发明的抑菌组培方法与常规的茶树组培方法相比，结果如表3所示，生根率和污染率的差异不显著。表3本发明抑菌组培方法的茶树瓶苗生根情况组培方式生根率(％)平均污染率(％)常规组培方法850.5抑菌组培方法880.34.成本分析：本发明的抑菌组培方法与常规组培的成本分析见表4。本发明组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从直接费用计算，每年可以节约5.5万元左右(以每天配制50L培养基计算)。常规组培还需要添置高压锅等设备及日常维护，此外，还存在实验室安全等问题。表4本发明的茶树抑菌组培方法与常规组培的成本分析表本发明具有如下有益效果：1.本发明的茶树抑菌组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭菌，减少了工作量和能源消耗，简化了茶树组培技术环节，降低了茶树组培成本。2.本发明的茶树抑菌组培方法，操作简单，只需按不同的培养基配方配制后即可，实用性强，推广性好。3.本发明的茶树抑菌组培方法与常规的茶树组培方法对比，可以降低成本10％以上。具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。实施例一：一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法一种利用抑菌培养基培育茶树的组培方法，包括以下步骤：1.培养容器消毒：将培养瓶、瓶盖及接种用的塑料盘在100mg/L次氯酸钠+10mg/L环丝氨酸+0.5mg/L十二烷基磺酸钠的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；2.培养基配制：诱导培养基为：MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIBA+60mg/L次氯酸钠+8mg/L乳酸链球菌素+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；增殖培养基为：MS+1.5mg/L6-BA+0.3mg/LIBA+1mg/LGA3+60mg/L次氯酸钠+8mg/L乳酸链球菌素+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；生根培养基为：1/2MS+2mg/LIBA+60mg/L次氯酸钠+8mg/L乳酸链球菌素+30mg/L丙酸钙+0.1mg/L十二烷基磺酸钠+30g/L蔗糖+3.0g/L琼脂粉，pH5.8；配制培养基时，先称各培养基配方中的蔗糖和琼脂粉，加培养基总重量1/2的自来水，加热至琼脂粉完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容，然后用1.0mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；3.无菌水的制备：采用次氯酸钠、环丝氨酸、十二烷基磺酸钠和水配制无菌水，终浓度为100mg/L次氯酸钠、10mg/L环丝氨酸、0.5mg/L十二烷基磺酸钠，现配现用；4.诱导培养：剪取无病虫害生长健壮的茶树新梢，剪去叶片后，剪成2～3cm长的带腋芽茎段，用洗衣粉浸泡冲洗15min后，用体积比为75％酒精消毒30s，再用重量体积比为0.1％升汞浸泡消毒12min，无菌水反复冲洗3次；消毒后的茎段在无菌条件下接种于诱导培养基上，培养30d后长出新芽；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1000Lx；5.增殖培养：将诱导出的新芽转入增殖培养基中，30d后逐步诱导出丛生芽；将丛生芽切开，或将长的新芽再切成带腋芽的茎段，接种到增殖培养基上；每30d转接一次，可获得大量幼芽；培养室温度为26℃，光照12h，光照强度为1400Lx；6.生根培养：取高度为3～5cm芽苗，接种到生根培养基上，培养25d后成为完整植株；培养室温度为25℃，光照12h，光照强度为1500Lx；7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后，移栽至透水性好的微酸性土壤中，大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环境温度为22～28℃。当前第1页1 2 3