本发明涉及一种梭子蟹用诱抗素的制备及应用，具体为采用诱抗素诱导梭子蟹成为多倍体水产动物的方法。
背景技术：
三疣梭子蟹的渔汛一年有春秋两次，渔期长，产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉多，脂膏肥满，味鲜美，营养丰富。每百克蟹内含蛋白质14克、脂肪2．6克。鲜食以蒸食为主，还可盐渍加工“枪蟹”、蟹酱，蟹卵经漂洗晒干即成为“蟹籽”，均是海味品中之上品。肉除鲜食外，还可制作罐头,畅销国内外。壳可作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。黄海和东海年产量各有1～2万吨上下。为中国最重要的海产蟹，经济意义重大。近似种南海和东海还有远海梭子蟹和红星梭子蟹，在南海为常见经济种。是中国重要的出口畅销品之一，出口输往国别和地区：日本，香港、澳门。出口口岸：辽宁、河北、天津、山东、江苏、浙江、福建。
实践证明,三倍体水产动物具有生长迅速、肉质改善及生物基因污染风险降低等优势一个普遍特征是性腺发育受阻。近年来,养殖蟹类特别是养殖的梭子蟹个体小型化、性早熟等现象比较突出,三倍体性腺的不育性有望解决其性早熟问题,从而培育大规格的梭子蟹,提高养殖产量和经济效益，与二倍体群体相比,放养后68~106d,三倍体群体在壳长、壳宽、体质量上都表现出明显的生长优势(P<0.01),并且其营养组成与二倍体蟹存在差异。三倍体幼蟹蟹体氨基酸总量高于正常二倍体幼蟹,必需氨基酸中苏氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、精氨酸、异亮氨酸、组氨酸和赖氨酸的含量高于二倍体,而关于三倍体蟹类生产性状的研究较少因此开展蟹类的多倍体诱导研究十分必要并具有重要的研究和生产意义。
已有的诱抗素：通过化学试剂抑制极体释放或第一次细胞分裂产生三倍体或四倍体的方法。常用的多倍体诱抗素主要有细胞松弛素B(CB)、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、咖啡因、秋水仙素等。目前,细胞松弛素B因价格高且对人体及生物具有较大的生物毒性,目前应用已不多。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种高效制备多倍体三疣梭子蟹的方法。使得所需的梭子蟹产品品质更加完美。
梭子蟹的养殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底过多的淤泥，翻松曝晒池底，另外还要维修塘堤、闸门、水渠等配套设施；设置障碍物，为了便于蟹苗休息和隐藏,当整修好池塘后，还要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障碍物；进水并繁殖饵料生物，清塘半个月以后，就可以开闸进水，为了防止一些有害生物进入池子，可以用60-80目的筛绢网过滤海水，池水深度一般保持在60-80公分，池塘进水后，要施用化肥来培育饵料生物，一般N肥在1.5-2㎏/亩，P肥为0.3-0.5㎏/亩，并且要保持池水的透明度在20-30公分左右。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现。本发明提供了一种三疣梭子蟹诱抗素的制备方法及用量比例。
本发明所用梭子蟹用诱抗素：利用细胞松弛素B(CB)3-5份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)1-3份和氯化钾(KCl)2-4份。诱导蟹三倍体和四倍体的方法,分别利用上述诱抗素处理抱卵蟹,在囊胚期检测的最高三倍体率分别为47-49%,51-52%和75-77%,四倍体最高诱导率依次是48-50%,53-55%和78-80%。并且使用KCl对抱卵蟹诱导处理获得的溞状幼体最高三倍体诱导率为85.3%,最高四倍体诱导率27.3%。该研究克服了以往三倍体诱导中离体培养的困难,首次获得了蟹三倍体溞状幼体,并极大提高了溞状幼体阶段四倍体诱导率。
诱抗素参数优化：本发明者利用KCl诱导蟹三倍体的关键参数进行了优化,优化的结果为:10-15℃,将产卵后1.5-2h孵化膜形成并举起作为中华绒螯蟹三倍体诱导起始点的形态学标记,以4-6g/L的KCl溶液处理4h,获得了最高为100%的离体卵三倍体诱导率。另外,对三疣梭子蟹的三倍体诱导进行了尝试,利用6-DMAP和KCl处理获得。
利用免疫荧光组织化学方法研究细胞骨架结构在多倍体诱导处理前后的变化可以阐明其工作机理。本发明者曾利用其他的技术手段进行了研究以期阐明利用诱导蟹多倍体的工作机理,但由于其受精卵卵径大、卵黄颗粒多,再加上外被坚韧的卵膜阻止了免疫抗体进入卵内与细胞骨架的结合,故此前在这方面的研究进展缓慢。有了KCl诱导多倍体工作机理的阐明可以加快蟹类多倍体育种的进程。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改或者对其中部分技术特征进行等同替换而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
现把梭子蟹用诱抗素的有关技术简要介绍如下：梭子蟹的养殖→已有的诱抗素→本发明所用梭子蟹用诱抗素→诱抗素参数优化。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚。下面将结合本发明的实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
梭子蟹的养殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底过多的淤泥，翻松曝晒池底，另外还要维修塘堤、闸门、水渠等配套设施；设置障碍物，为了便于蟹苗休息和隐藏,当整修好池塘后，还要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障碍物；进水并繁殖饵料生物，清塘半个月以后，就可以开闸进水，为了防止一些有害生物进入池子，可以用60目的筛绢网过滤海水，池水深度一般保持在60公分，池塘进水后，要施用化肥来培育饵料生物，一般N肥在1.5㎏/亩，P肥为0.3㎏/亩，并且要保持池水的透明度在20公分左右。利用细胞松弛素B(CB)3份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)1份和氯化钾(KCl)2份。诱导蟹三倍体和四倍体的方法,分别利用上述诱抗素处理抱卵蟹,在囊胚期检测的最高三倍体率分别为47%,51%和75%,四倍体最高诱导率依次是48%,53%和78%。
实施例2
梭子蟹的养殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底过多的淤泥，翻松曝晒池底，另外还要维修塘堤、闸门、水渠等配套设施；设置障碍物，为了便于蟹苗休息和隐藏,当整修好池塘后，还要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障碍物；进水并繁殖饵料生物，清塘半个月以后，就可以开闸进水，为了防止一些有害生物进入池子，可以用80目的筛绢网过滤海水，池水深度一般保持在80公分，池塘进水后，要施用化肥来培育饵料生物，一般N肥在2㎏/亩，P肥为0.5㎏/亩，并且要保持池水的透明度在30公分左右。利用细胞松弛素B(CB)5份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)3份和氯化钾(KCl)4份。诱导蟹三倍体和四倍体的方法,分别利用上述诱抗素处理抱卵蟹,在囊胚期检测的最高三倍体率分别为49%,52%和77%,四倍体最高诱导率依次是50%,55%和80%。
实施例3
梭子蟹的养殖：池塘的整理，池塘整理主要是清除池底过多的淤泥，翻松曝晒池底，另外还要维修塘堤、闸门、水渠等配套设施；设置障碍物，为了便于蟹苗休息和隐藏,当整修好池塘后，还要在池底放上水泥管、瓦片、竹筒等障碍物；进水并繁殖饵料生物，清塘半个月以后，就可以开闸进水，为了防止一些有害生物进入池子，可以用70目的筛绢网过滤海水，池水深度一般保持在70公分，池塘进水后，要施用化肥来培育饵料生物，一般N肥在1.8㎏/亩，P肥为0.4㎏/亩，并且要保持池水的透明度在25公分左右。利用细胞松弛素B(CB)4份、6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)2份和氯化钾(KCl)3份。诱导蟹三倍体和四倍体的方法,分别利用上述诱抗素处理抱卵蟹,在囊胚期检测的最高三倍体率分别为48%，51.2%和76%，四倍体最高诱导率依次是49%，54%和79%。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所做的更动和润饰，均应属于本发明所附权利要求的保护范围。