本发明涉及一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，属于无激素培养技术领域。
背景技术：
铁皮石斛（学名：Dendrobium officinale Kimura et Migo）:茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4毫米，不分枝，具多节；叶二列，纸质，长圆状披针形，边缘和中肋常带淡紫色。总状花序常从落了叶的老茎上部发出，具2-3朵花；花苞片干膜质，浅白色，卵形，长5-7毫米，萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，唇瓣白色，基部具1个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折。蕊柱黄绿色，长约3毫米，先端两侧各具1个紫点；药帽白色，长卵状三角形，长约2.3毫米，顶端近锐尖并且2裂。花期3-6月。
铁皮石斛原球茎已经被证明含有与铁皮石斛鲜茎相类似的有效营养成分，可以作为植物多糖的富集提取原料。但是长时间以来铁皮石斛原球茎都只是在科研院校实验室做研究用，或者在植物工厂做为铁皮石斛种苗的育种胚芽，不管从生产规模还是成品率都远远没有达到工业化生产的要求。
新鲜的原球茎烘干制成原球茎干品的过程中，有一个“得干率”可以作为原球茎干品质量的参考。得干率越高，成品率就越高，相对的质量也就越好。一般实验室使用纯固体培养基制备原球茎，其得干率只有3~5%，而且制备过程中很容易分化发芽，影响再次继代增殖。
如果使用纯液体培养基制备原球茎，其得干率会比固体培养的制备的略高2~3%，但是在数次继代中，原球茎的增殖速度会逐代降低，所的原球茎颗粒偏大，中间易失活，得干率也逐步下降。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，该项工艺大大提高了原球茎的增殖倍率并提高了它的得干率，使铁皮石斛原球茎的工业化生产有了实际应用的价值。
按照本发明提供的技术方案，一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，步骤如下：
（1）铁皮石斛播种：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导原料，将铁皮石斛种子播种到无激素培养基G0上，种子平铺培养基平面；培养条件为温度20~28℃，光照2000~3000Lx，培养12~15天，得到膨大后的铁皮石斛种子；
（2）原球茎诱导：将步骤（1）所得膨大后的铁皮石斛种子接种进液体培养基G1中，接种量为每200mL 8~10克；放置在摇床上均匀振荡，振荡频率为80~110转/分钟，保持温度20~28℃，光照2000~3000Lx，培养15天继代一次，继代2~3次后，种子发育为原球茎；
（3）原球茎增殖：
a、将步骤（2）所得液体培养基G1中的原球茎转移到固体培养基G2中培养，接种量为每200mL 8~10克；条件为温度20~28℃，光照2000~3000Lx，培育30~45天；
b、将步骤a中所得固体培养基G2中的原球茎转接到液体培养基G3中培养，接种量为30~50克/600mL瓶；条件为温度保持20~28℃，光照2000~3000Lx，摇床转速为80~100转/分钟；30~45天后继代一次；
（4）原球茎出品：将步骤（3）所得液体培养基G3中的原球茎接种至出品前的无激素培养基G4中，接种量为每200mL 8~10克；30天后转接至容积为18L的气室桶中，桶内装有液体培养基G5，14L，接种量为1200~1500克/桶，培养期间持续向桶内充入洁净空气，充气量为0.2~0.25立方米/小时；培养30天后至满瓶，可直接得到无激素铁皮石斛原球茎产品。
步骤（1）所述无激素培养基G0具体组分为1/2MS培养基+90~110g/L土豆+20g/L蔗糖+5~6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.0。
步骤（2）所述液体培养基G1为1/2MS培养基+0.2~0.5mg/L 6-BA+10g/L香蕉+20~25g/L蔗糖，pH6.2；
步骤（3）所述固体培养基G2为：1/2MS培养基+0.2~0.5mg/L 6-BA+0.20~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+20~25g/L蔗糖+5~6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
液体培养基G3配方为1/2MS培养基+0.20~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+20~25g/L蔗糖，pH6.2。
步骤（4）所述无激素培养基G4为1/2MS培养基+0.20~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+20~25g/L蔗糖+5~6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
所述液体培养基G5配方为1/2MS培养基+0.25~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖，pH6.2。
本发明的有益效果：本发明大大提高了原球茎的增殖倍率并提高了它的得干率，使铁皮石斛原球茎的工业化生产有了实际应用的价值。由于本发明采用无激素的生产方式，因此得到的产品符合相关检验要求，可以达到上市要求。
具体实施方式
实施例1
一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，步骤如下：
（1）铁皮石斛播种：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导原料，将铁皮石斛种子播种到无激素培养基G0上，种子平铺培养基平面，培养基约为200mL，高度2cm，种子薄薄的铺一层；培养条件为温度20℃，光照3000Lx，培养12天，得到膨大后的铁皮石斛种子；
（2）原球茎诱导：将步骤（1）所得膨大后的铁皮石斛种子接种进液体培养基G1中，接种量为每200mL 8克；放置在摇床上均匀振荡，振荡频率为80转/分钟，保持温度20℃，光照2000Lx，培养15天继代一次，继代2次后，种子发育为原球茎；
（3）原球茎增殖：
a、将步骤（2）所得液体培养基G1中的原球茎转移到固体培养基G2中培养，接种量为每200mL 8克；条件为温度20℃，光照2000Lx，培育30天；
b、将步骤a中所得固体培养基G2中的原球茎转接到液体培养基G3中培养，接种量为30克/600mL瓶；条件为温度保持20℃，光照2000Lx，摇床转速为80转/分钟；30天后继代一次；
（4）原球茎出品：将步骤（3）所得液体培养基G3中的原球茎接种至出品前的无激素培养基G4中，接种量为每200mL 8克；30天后转接至容积为18L的气室桶中，桶内装有液体培养基G5，14L，接种量为1200克/桶，培养期间持续向桶内充入洁净空气，充气量为0.2立方米/小时；培养30天后至满瓶，可直接得到无激素铁皮石斛原球茎产品。
步骤（1）所述无激素培养基G0具体组分为1/2MS培养基+90g/L土豆+20g/L蔗糖+5g/L卡拉胶/琼脂，pH6.0。
步骤（2）所述液体培养基G1为1/2MS培养基+0.2mg/L 6-BA+10g/L香蕉+20g/L蔗糖，pH6.2；
步骤（3）所述固体培养基G2为：1/2MS培养基+0.2mg/L 6-BA+0.20~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+20g/L蔗糖+5g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
液体培养基G3配方为1/2MS培养基+0.20g/L蛋白胨+100g/L土豆+20g/L蔗糖，pH6.2。
步骤（4）所述无激素培养基G4为1/2MS培养基+0.20g/L蛋白胨+100g/L土豆+20g/L蔗糖+5g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
所述液体培养基G5配方为1/2MS培养基+0.25g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖，pH6.2。
实施例2
一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，步骤如下：
（1）铁皮石斛播种：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导原料，将铁皮石斛种子播种到无激素培养基G0上，种子平铺培养基平面，培养基约为200mL，高度2cm，种子薄薄的铺一层；培养条件为温度28℃，光照3000Lx，培养15天，得到膨大后的铁皮石斛种子；
（2）原球茎诱导：将步骤（1）所得膨大后的铁皮石斛种子接种进液体培养基G1中，接种量为每200mL 10克；放置在摇床上均匀振荡，振荡频率为110转/分钟，保持温度28℃，光照3000Lx，培养15天继代一次，继代3次后，种子发育为原球茎；
（3）原球茎增殖：
a、将步骤（2）所得液体培养基G1中的原球茎转移到固体培养基G2中培养，接种量为每200mL 10克；条件为温度28℃，光照3000Lx，培育45天；
b、将步骤a中所得固体培养基G2中的原球茎转接到液体培养基G3中培养，接种量为50克/600mL瓶；条件为温度保持28℃，光照3000Lx，摇床转速为100转/分钟； 45天后继代一次；
（4）原球茎出品：将步骤（3）所得液体培养基G3中的原球茎接种至出品前的无激素培养基G4中，接种量为每200mL 10克；30天后转接至容积为18L的气室桶中，桶内装有液体培养基G5，14L，接种量为1500克/桶，培养期间持续向桶内充入洁净空气，充气量为0.25立方米/小时；培养30天后至满瓶，可直接得到无激素铁皮石斛原球茎产品。
步骤（1）所述无激素培养基G0具体组分为1/2MS培养基+110g/L土豆+20g/L蔗糖+6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.0。
步骤（2）所述液体培养基G1为1/2MS培养基+0.5mg/L 6-BA+10g/L香蕉+25g/L蔗糖，pH6.2；
步骤（3）所述固体培养基G2为：1/2MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖+6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
液体培养基G3配方为1/2MS培养基+0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖，pH6.2。
步骤（4）所述无激素培养基G4为1/2MS培养基+0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖+6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
所述液体培养基G5配方为1/2MS培养基+0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖，pH6.2。
实施例3
一种无激素工业化培育铁皮石斛原球茎的方法，步骤如下：
（1）铁皮石斛播种：使用铁皮石斛成熟果荚作为原球茎的诱导原料，将铁皮石斛种子播种到无激素培养基G0上，种子平铺培养基平面，培养基约为200mL，高度2cm，种子薄薄的铺一层；培养条件为温度24℃，光照2500Lx，培养14天，得到膨大后的铁皮石斛种子；
（2）原球茎诱导：将步骤（1）所得膨大后的铁皮石斛种子接种进液体培养基G1中，接种量为每200mL 9克；放置在摇床上均匀振荡，振荡频率为100转/分钟，保持温度25℃，光照2500Lx，培养15天继代一次，继代2次后，种子发育为原球茎；
（3）原球茎增殖：
a、将步骤（2）所得液体培养基G1中的原球茎转移到固体培养基G2中培养，接种量为每200mL 9克；条件为温度24℃，光照2500Lx，培育40天；
b、将步骤a中所得固体培养基G2中的原球茎转接到液体培养基G3中培养，接种量为40克/600mL瓶；条件为温度保持25℃，光照2500Lx，摇床转速为90转/分钟；35天后继代一次；
（4）原球茎出品：将步骤（3）所得液体培养基G3中的原球茎接种至出品前的无激素培养基G4中，接种量为每200mL9克；30天后转接至容积为18L的气室桶中，桶内装有液体培养基G5，14L，接种量为1350克/桶，培养期间持续向桶内充入洁净空气，充气量为0.22立方米/小时；培养30天后至满瓶，可直接得到无激素铁皮石斛原球茎产品。
步骤（1）所述无激素培养基G0具体组分为1/2MS培养基+100g/L土豆+20g/L蔗糖+6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.0。
步骤（2）所述液体培养基G1为1/2MS培养基+0.4mg/L 6-BA+10g/L香蕉+24g/L蔗糖，pH6.2；
步骤（3）所述固体培养基G2为：1/2MS培养基+0.4mg/L 6-BA+0.25g/L蛋白胨+100g/L土豆+23g/L蔗糖+5~6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
液体培养基G3配方为1/2MS培养基+0.25g/L蛋白胨+100g/L土豆+23g/L蔗糖，pH6.2。
步骤（4）所述无激素培养基G4为1/2MS培养基+0.20~0.3g/L蛋白胨+100g/L土豆+23g/L蔗糖+6g/L卡拉胶/琼脂，pH6.2；
所述液体培养基G5配方为1/2MS培养基+0.28g/L蛋白胨+100g/L土豆+25g/L蔗糖，pH6.2。
通过以上四步，铁皮石斛原球茎总重可以达到最初诱导量的2560倍，得干率可以达到10%左右。其多糖含量和抗氧化性均可达到优质石斛鲜茎的水准，甚至优于鲜茎。
本发明使用的固液态培养基交替的方式，可以同时解决上述两个生产方式中的问题，既能保持原球茎的活力，使其真正做到百代继代而保持稳定的生物特性，不会提前出现分化发芽现象。同时，由于本发明培养基中添加了充足的营养物质，所以在30~36天的时候，原球茎可以达到得干率的最高峰，接近13%。