基于愈伤组织诱导再生途径提高玉露繁殖率的方法与流程

本发明涉及一种植物组织培养技术领域，更确切地说涉及一种基于愈伤组织诱导再生途径提高玉露繁殖率的方法。

背景技术：

为应对干旱等逆境，某些植物的营养器官（茎、叶或根）进化为具有发达的薄壁组织，在外观上显得肥厚多汁，高度肉汁化结构得以使植物贮藏大量水分，进而适应干旱少雨的气候，这类植物统称为多肉植物（succulent plant）。全球范围内已知多肉植物包括100余个科的10000多种植物。其高效贮水的特征，加之小巧株型，成为园艺爱好者收集栽培的宠儿。

玉露为百合科十二卷属“软叶系”多肉植物。初为单生，后渐呈群生状，叶片肥厚饱满，翠绿色，上半段呈透明或半透明状，称为“窗”。在太阳光下犹如鲜活的工艺品，极有利于调节心情，为办公室或家中书桌、卧室、阳台等处极佳的观赏装饰物。近年来玉露已成为最受消费者青睐的小型多肉植物品种之一。

经过长期杂交选育，目前已育成了冰灯玉露、黑肌玉露等多种优良品种。传统的繁殖方法通常采用叶片扦插及底座繁殖等方法，此类方法繁殖率极低，且繁殖速度过慢，难以生产足够的玉露植株满足市场需求，导致玉露市场价格极高。植物组织培养技术为玉露快速繁殖提供了一种快速便捷的方法。当前有关玉露组织培养的报道大多集中在利用玉露叶片或花茎直接诱导丛生芽，如专利ZL201510197424公开了一种以玉露叶片为外植体诱导丛生芽的方法，但每个外植体仅能长出3～4个丛生芽，这难以大幅提高玉露的繁殖效率。新近有报道以当年抽生的花序为外植体建立玉露快速繁殖体系。这一定程度提高了玉露繁殖效率，但仍存在外植体取材时间限制、分化率较低且操作步骤繁琐等问题，难以实现经济节约的商业化生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于愈伤组织诱导再生途径提高玉露繁殖率的方法。

本发明所采用的技术方案是：以玉露叶片为外植体，经液体二氧化氯消毒后接种于愈伤组织诱导培养基，获得愈伤组织；所获愈伤组织继代培养或转接至分化培养基，得到再生绿芽，置于生根培养基中生根长成完整植株，再炼苗移栽，以此大幅提高玉露繁殖率。

其包括如下步骤：

1、外植体表面消毒：选择健康无菌斑的玉露叶片为外植体，自来水下冲洗2小时，然后在超净工作台中用25～150 mg/L液体二氧化氯浸泡15～40分钟进行表面消毒，每5分钟摇动一次，然后直接用无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌外植体。

2、愈伤组织诱导：将消毒后的玉露叶片横切为约0.5 cm段，接种于愈伤组织诱导培养基，在25℃±1℃、光照强度600～800 Lux、光照周期8～10小时/天条件下培养25天获得愈伤组织。愈伤组织可在诱导培养相同条件下继代培养，也可直接转至分化培养基进行幼芽分化。

3、愈伤组织分化：将诱导或继代的愈伤组织转入分化培养基，在25±1℃、光照强度800～1200 Lux、光照周期14小时/天条件下培养，25～30天可获得大量2 cm长绿芽。

4、生根培养：将步骤（3）所获绿芽接种至生根培养基，在25±1℃、光照强度800～1200 Lux、光照周期14小时/天条件下培养，25～30天可获得生根植株。

5、炼苗移栽：在室温下加入蒸馏水对生根植株进行炼苗3天左右，取出植株将根上残留培养基冲洗干净，用纱布吸干表面水分，移栽至砂质营养土，转至遮荫、温度23～25℃条件下生长。

所述的液体二氧化氯采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应生成，称取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL去蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450 mL蒸馏水，混匀即获得1000 mg/L二氧化氯水溶液。所述的液体二氧化氯临用前稀释至25～150 mg/L所需浓度。

所述的愈伤诱导培养基以MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖、7.0 g/L琼脂或2.5 g/L植物凝胶、1.0 mg/L 吲哚乙酸和1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤组合，用1.0 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

所述的愈伤组织分化培养基以MS培养基为基本培养基，添加30 g/L蔗糖、7.0 g/L琼脂或2.5 g/L植物凝胶、0.5 mg/L α-萘乙酸、0.5 mg/L呋喃甲基腺嘌呤、20～40 g/L甘露醇和1～15 mg/L硫酸铜，用1.0 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

所述的生根培养基以MS为基本培养基，添加30 g/L蔗糖、7.0 g/L琼脂或2.5 g/L植物凝胶，不含外源激素，用1 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

所述的MS培养基包括1900 mg/L 硝酸钾、1650 mg/L硝酸铵、170 mg/L 磷酸二氢钾、370 mg/L七水硫酸镁、440 mg/L二水氯化钙、27.85 mg/L 七水硫酸铁、37.25 mg/L乙二胺四乙酸二钠、22.3 mg/L 四水合硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6.2 mg/L 硼酸、0.83 mg/L碘化钾、0.025 mg/L五水硫酸铜、0.25 mg/L二水合钼酸钠、0.025 mg/L六水氯化钴、2.0 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L盐酸硫胺素、0.5 mg/L盐酸吡哆辛、0.5 mg/L烟酸、100 mg/L肌醇。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：以玉露叶片为外植体，经表面消毒后进行愈伤组织诱导、分化及生根获得完整植株，有效提高了玉露的繁殖率，且操作较为简单、不受取材时间限制，适合于玉露的规模化生产，能快速繁殖出健壮的玉露幼苗，有望大幅度降低玉露生产成本。

附图说明

图1 是所诱导玉露愈伤组织照片。

图2 是愈伤组织分化培养2周后形成的芽点照片。

图3 是显微镜下拍摄玉露再生绿芽照片。

图4 是分化培养28天后培养瓶中玉露绿芽照片。白色箭头示意可用于生根培养的绿芽。

图5 是生根培养2周后玉露植株。

图6 是移栽成活的玉露植株。

具体实施方式

下面结合具体的实施方式来进一步说明本发明。应当理解这里描述的具体实施方式只是作为示例来帮助本领域技术人员更好地理解本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的实验方法和操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导。

本发明所述的方法包括以下步骤：

1、外植体表面消毒：选择健康无菌斑的玉露叶片为外植体，自来水下冲洗2小时，然后在超净工作台中用80 mg/L液体二氧化氯浸泡25分钟进行表面消毒，每5分钟摇动一次，然后直接用无菌滤纸吸干表面水分，获得无菌外植体。

本实施例中80 mg/L液体二氧化氯浸泡健康玉露叶片25分钟高效地实现了外植体表面消毒，无菌材料获得率超过95%。这种消毒方式对后期材料培养未产生负面影响，且后期培养中愈伤组织诱导比传统升汞消毒方法的更快。

2、愈伤组织诱导：将消毒后的玉露叶片横切为约0.5cm段，接种于愈伤组织诱导培养基，在25℃±1℃、光照强度700 Lux、光照周期9小时/天条件下培养25天获得愈伤组织。愈伤组织可在诱导培养相同条件下继代培养，也可直接转至分化培养基进行幼芽分化。愈伤诱导培养基以MS为基本培养基，含30 g/L蔗糖、7.0 g/L琼脂或2.5 g/L植物凝胶，添加1.0 mg/L 吲哚乙酸和1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤组合，用1.0 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

本发明在具体实施中发现，在培养基中单独添加愈伤诱导培养中常用的2.0 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸时，所有外植体均可产生愈伤，但愈伤呈水渍状，不能进行继代培养；而在培养基中添加1.0 mg/L 吲哚乙酸和1.0 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤可诱导疏松颗粒状愈伤，诱导率达到100%。如图1所示，在愈伤组织诱导培养基中培养25天后，大量胚性愈伤组织形成，愈伤组织诱导率达到100%。该类愈伤组织生长速度快，15天内繁殖率达12倍，短时间内即可获得大量愈伤组织用于绿芽分化。

3、愈伤组织分化：将诱导或继代的愈伤组织转入分化培养基，在25±1℃、光照强度1000 Lux、光照周期14小时/天条件下培养，28天可获得大量2 cm长的绿芽。愈伤组织分化以MS培养基为基本培养基，含30 g/L蔗糖、7.0 g/L琼脂或2.5 g/L植物凝胶、0.5 mg/L α-萘乙酸，另加0.5 mg/L 呋喃甲基腺嘌呤、20～40 g/L甘露醇和1～15 mg/L硫酸铜，用1.0 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

如图2所示，在分化培养基中培养10天后，愈伤组织开始膨大并胚状化，表面产生芽点；如图3、图4所示，25天左右，大量绿芽生成，大多长2 cm左右。在MS基本培养基中添加呋喃甲基腺嘌呤、α-萘乙酸、蔗糖、植物凝胶、硫酸铜、甘露醇，绿芽分化率达到了72%，且每个愈伤块可产生超过10个健康绿芽，大幅提高了绿芽诱导率。甘露醇作为高渗剂，可在愈伤组织分化培养期间保持外植体表面干燥，不收水渍影响。铜离子对细胞色素c氧化酶介导的电子转移反应极为重要，加速叶绿体膜系统的发育形成，有助于绿芽分化。

4、生根培养：将步骤3所获绿芽接种至生根培养基，在25±1℃、光照强度1000 Lux、光照周期14小时/天条件下培养，25～30天可获得生根植株。生根培养基以MS为基本培养基，另含30g/L蔗糖、7.0g/L琼脂或2.5g/L植物凝胶，不含外源激素，用1 mol/L氢氧化钾调节pH值至5.8～6.0。

如图5所示，将步骤3的绿芽转至不含外源激素的生根培养基中培养15天后，超过85%的玉露绿芽均产生了健康根系。

5、炼苗移栽：在室温下打开培养瓶，加入蒸馏水对生根植株进行炼苗3天左右，取出植株将根上残留培养基冲洗干净，用纱布吸干表面水分，移栽至砂质营养土，转至遮荫、温度23～25℃条件下生长（如图6所示），移栽成活率超过80%。

本实施例所述的液体二氧化氯采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应生成，称取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL去蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450 mL蒸馏水，混匀即获得1000 mg/L二氧化氯水溶液。临用前稀释至25～150 mg/L所需浓度。

本实施例所述的MS培养基包括1900 mg/L 硝酸钾、1650 mg/L硝酸铵、170 mg/L 磷酸二氢钾、370 mg/L七水硫酸镁、440 mg/L二水氯化钙、27.85 mg/L 七水硫酸铁、37.25 mg/L乙二胺四乙酸二钠、22.3 mg/L 四水合硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6.2 mg/L 硼酸、0.83 mg/L 碘化钾、0.025 mg/L五水硫酸铜、0.25 mg/L二水合钼酸钠、0.025 mg/L 六水氯化钴、2.0 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L 盐酸硫胺素、0.5 mg/L 盐酸吡哆辛、0.5 mg/L 烟酸、100 mg/L 肌醇。