一种外源GA3诱导月季成花的方法与流程

本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种外源GA3诱导月季成花的方法，具体涉及一种外源GA3诱导月季无菌苗开花的方法。

背景技术：

月季(Rosahybrida)在我国已经有1000多年的历史，主要分为种丰花月季、壮花月季、藤蔓月季、香水月季、灌木月季和月季六大类。2005～2008年三年间，总共831个月季品种在国际上登录，这当中有丰花月季169个、杂种香水月季204个、小花月季89个、灌丛月季161个、月季106个。在国外，月季在17-18世纪传入英国和法国。在此之后，欧洲人民将其作为重要种质与蔷薇进行杂交，培育出众多优质的新品种。目前，全世界培育了20000多月季新品种。在国内，科学家们经过大量探索，成功培育出多种抗寒、抗旱、抗病的优良月季新品，并进行了改变花色的育种。时至今日，大多数月季种质资源还未曾用于人工育种，其优良性状还没有得到挖掘和开发，月季新品种培育因此拥有着巨大的潜力。在国内外传统育种过程中，科学家们大多只注重于月季表观性状的改良，如花的形态、直径、数量，而忽视了如成活率、寿命、耐受能力等优秀品质的保留，这就导致了多种月季优良品质的缺失，致使品种的衰退。因此，传统的杂交育种方法远不能满足人们日益提高的审美要求。

为了满足人们的需要，组织培养技术在上个世纪末应运而生，以此为基础的转基因手段为传统的月季育种提供了一条全新途径。这种手段可以高效将优良的外源基因转入到生物体当中并得以表达，同时保持生物体性状相对的稳定性。稳定的组培体系和基因转化体系对月季新品种的获得意义重大，并已获得重大成就。

外源植物激素与植物的成花过程息息相关，不同激素种类及配比对组培苗的成花诱导千差万别。有相关研究证明：添加外源的植物生长调节剂是诱导植物成花的必要条件，且只有当外源植物生长调节剂的浓度和配比适宜时，才能诱导植物达到最高的成花率。关于对外源植物生长调节剂对植物成花的报道，科学家们大多选择GA3进行相关研究，因为GA3可以对植物分枝和成花有着明显影响。一些学者报道：GA3促进植物生长并使花期提前，加速其生活周期，并且能增强花卉品质，增加其观赏价值。研究表明：外施GA3能够打破月季枝条的休眠状态，并且使开花率大大提高；喷施以50mg/L的GA3对枝条的伸长、叶片质量、花数量及鲜重都有促进作用，同时增益花瓣颜色品质。另有研究表明：外源GA3处理后的月季枝条与未经过处理的枝条相以，其生长发育速度明显加快。因此，在月季无菌苗的基础上，探究外源GA3对月季成花的影响对克服月季成花率低，开花周期长，并培育出生长状态良好，色泽艳丽，观赏性强的月季有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于在月季无菌苗培育过程中，提供一种施加外源GA3的方法，从而快速诱导月季花芽，缩短成花周期，增强花卉品质，增加其观赏价值，使月季无菌苗快速成花。

为实现上述目的，本发明所述的外源GA3诱导月季成花的方法是将外源GA3添加至月季无菌苗花芽诱导培养基中，具体配方为MS培养基+蔗糖+琼脂+赤霉素(GA3)；其中，所述蔗糖的浓度为40g/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述GA3的浓度为100mg/mL，pH5.83～5.85，然后经过成花培养的过程，成功诱导出色泽艳丽的月季花朵。

该方法的具体步骤如下：

(1)月季无菌苗的获得

a、于花市购买普通月季，高约20cm-40cm，花色不限；剪取月季当年生健壮枝条，以软毛刷清除其表面灰尘，置于盛有清水的烧杯中，加少量清洗剂浸泡10min，期间不断摇动烧杯，流水冲洗1h，Cl₂灭菌20min；超净工作台中，无菌蒸馏水浸泡清洗3次，无菌滤纸吸干。

b、取步骤a)中的月季枝条，剪取1.5cm-2cm单芽茎段，形态学下端接种于芽诱导培养基中；其中，所述的芽诱导培养基为MS培养基+噻苯隆(TDZ)+萘乙酸(NAA)+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.1mg/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，pH值为5.83～5.85；接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养30d。

c、取步骤b)中的培养30d后的无菌苗，超净工作台中，将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于芽增殖培养基中，每瓶均匀接种4个茎段；其中，所述的芽增殖培养基为MS培养基+TDZ+NAA+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.05mg/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，pH值为5.83～5.85；接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养45d后，获得月季无菌苗。

(2)花芽诱导培养

取步骤(1)月季无菌苗，在超净工作台中，切取生长健壮的月季无菌苗单芽茎段，形态学下端接种于施加GA3的花芽诱导培养基中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后标注日期；其中，所述花芽诱导培养基为MS培养基+蔗糖+琼脂+赤霉素(GA3)，所述蔗糖的浓度为40g/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述GA3的浓度为100mg/mL，pH值为5.83～5.85；培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养40d后，获得月季的丛生芽；

(3)成花培养

取步骤(2)中培养40d的月季丛生芽切取为单丛，接种于芽增殖培养基中；其中，所述芽增殖培养基为MS培养基+TDZ+NAA+活性炭+蔗糖+琼脂，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.1mg/L，所述活性炭的浓度为0.6g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，所述琼脂的浓度为7g/L，pH值为5.83～5.85；培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，10天后即可成花。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明的诱导月季成花的方法中，完整的提供了从普通月季植株到无菌苗成花这一过程，巧妙的运用外源激素GA3诱导月季花芽的形成，大大提高了月季的成花率，使成花率高达91.7％。

2、本发明的方法中，合理的调配从普通月季植株经植物组织培养过程至无菌苗成花各个阶段的培养基配方，和花芽诱导过程中所施加的外源GA3浓度，可快速诱导月季花芽，缩短成花周期，保证最终培育出的月季无菌苗花朵色泽艳丽、花期长，观赏价值增加，对月季无性育种具有重要的理论和实践意义，具有巨大的经济效益。

附图说明

图1本发明实验室培养获得的月季无菌苗。

图2本发明花诱导培养过程中获得的月季丛生芽。

图3本发明成功开花的月季再生植株。

具体实施方式

为使本领域的技术人员清楚明白本发明的技术方案及其优点，下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

实施例1

本发明具体实施方式里所用到的MS培养基的配制是参照中国专利CN 104115743 B中记载的MS培养基的配制方法进行配制的。而且，所有培养基配制好后均采用121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基冷凝至室温后方可使用。

1)、月季无菌苗的获得

a、于花市购买普通月季，高约20cm-40cm，花色粉红，剪取月季当年生健壮枝条，以软毛刷清除其表面灰尘，置于盛有清水的烧杯中，加少量清洗剂(1-3滴白猫洗洁精)浸泡10min，期间不断摇动烧杯，流水冲洗1h，Cl2灭菌20min；超净工作台中，无菌蒸馏水浸泡清洗3次，无菌滤纸吸干。

b、取步骤a)中的月季枝条，剪取1.5cm-2cm单芽茎段，形态学下端接种于芽诱导培养基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85中，接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养30d。

c、取步骤b)中的培养30d后的无菌苗，超净工作台中，将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于芽增殖培养基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4个茎段，接种接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养45d后，获得月季无菌苗(如图1所示)。

2)、花芽诱导培养

取步骤1)月季无菌苗，在超净工作台中，切取生长健壮的月季无菌苗单芽茎段，形态学下端接种于施加GA3的花芽诱导培养基(MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+GA3100mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后标注日期，培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，获得月季的丛生芽(如图2所示)。

3)、成花培养

取步骤2)中培养40d的月季丛生芽切取为单丛，接种于芽增殖培养基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭0.6g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4丛，接种100瓶，接种后标注日期；培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗；10d后月季无菌苗成功开花(如图3所示)。

本发明按照上述方法培育出的月季无菌苗花朵色泽艳丽、花期长(15-25天)，观赏价值增加。同时，本发明按照上述方法重复试验3次；其中，无菌苗成功开花275瓶，不开花25瓶，成花率达91.7％。

本发明无菌苗的获得、花芽诱导培养过程对月季最终的成花情况均是有影响的，现将对其影响较大的GA3作为对比进行详细说明。

对比例1

1)、月季无菌苗的获得

具体操作步骤同实施例1。

2)、花芽诱导培养

取步骤1)月季无菌苗，在超净工作台中，切取生长健壮的月季无菌苗单芽茎段，形态学下端接种于不施加GA3的花芽诱导培养基(MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后标注日期，培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，获得月季的丛生芽。

3)、成花培养

具体操作步骤同实施例1。

结果：本发明按照上述方法培育出的月季无菌苗经成花培养后30d左右有花朵形成，花色较淡，花朵小，花期短(8-15天)重复试验3次；其中，无菌苗成功开花163瓶，不开花137瓶，开花率为54.3％。

对比例2

1)、月季无菌苗的获得

具体操作步骤同实施例1。

2)、花芽诱导培养

取步骤1)月季无菌苗，在超净工作台中，切取生长健壮的月季无菌苗单芽茎段，形态学下端接种于施加GA3的花芽诱导培养基(MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+GA350mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后标注日期，培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，获得月季的丛生芽。

3)、成花培养

具体操作步骤同实施例1。

结果：本发明按照上述方法培育出的月季无菌苗经成花培养后20d左右有花朵形成，花色较淡，花朵小，花期短(8-15天)，重复试验3次；其中，无菌苗成功开花186瓶，不开花114瓶，开花率为62％。

对比例3

1)、月季无菌苗的获得

具体操作步骤同实施例1。

2)、花芽诱导培养

取步骤1)月季无菌苗，在超净工作台中，切取生长健壮的月季无菌苗单芽茎段，形态学下端接种于施加GA3的花芽诱导培养基(MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+GA3200mg/mL)，pH5.83～5.85中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后标注日期，培养条件为：25℃，光强2000lux，光周期为16小时光照，8小时黑暗，获得月季的丛生芽。

3)、成花培养

具体操作步骤同实施例1。

结果：本发明按照上述方法培育出的月季无菌苗经成花培养后30d有花朵形成，花朵小，色泽差，花期短(5-10天)重复实验3次，无菌苗开花94瓶，未开花206瓶，花朵开花率仅为31.3％。具体GA3对月季无菌苗成花的影响见表1。

表1 GA3浓度对月季无菌苗成花的影响

通过上述实验可知，本发明外源GA3诱导月季成花的过程中，需要严格控制GA3的浓度，施加适当浓度的GA3对月季无菌苗成花有促进作用，GA3浓度高会延长成花时间，减少成花率，缩短了月季无菌苗花期。浓度过低对月季无菌苗成花作用不明显，但缩短了月季花期。本发明通过研究明确的提供了最适月季无菌苗成花的GA3浓度为100mg/mL，在此条件下生长的月季成花率可达91.7％，且花期较长，对月季的组织培养具有巨大的经济效益，对后续的分子生物学研究有重要的意义。

同时，本发明还曾尝试按照中国专利CN 104115743 B中无菌苗的获得方法培养无菌苗，然后按照实施例1中步骤(2)与步骤(3)的方式进行花芽诱导培养，最后进行成花培养，但成花培养后20d有花朵形成，花朵小，色泽差，花期短(8-15天)重复实验3次，花朵开花率仅为72.3％。因此，本发明对目前现有的月季无菌苗获得方法进行综合与改进，将TDZ与NAA进行配比，应用于芽诱导和芽增殖过程中，进行多次实验，最终选择了最适于月季无菌苗生成的TDZ与NAA的浓度配比，并在芽诱导过程中培养基使用MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，芽增殖过程中培养基使用MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L。通过此方法获得了生长状态良好，成活高的月季无菌苗。在此无菌苗基础上利用本发明的方法进行月季无菌苗的成花诱导，保证了月季成花品质，对获得成花率高，花朵色泽艳丽、花期长的月季有重要的意义。