一种莼菜丛生芽的诱导方法与流程

本发明提供一种莼菜丛生芽的诱导方法，属于植物组织培养
技术领域：
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背景技术：
：莼菜，属睡莲科的一种水草，列入中国国家Ⅰ级重点保护野生植物（国务院1999年8月4日批准），是珍贵的野生水生蔬菜，含有酸性多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、组胺和微量元素等，其价值主要体现在医用价值和食用价值。莼菜含有丰富的胶质蛋白、碳水化合物，脂肪、多种维生素和矿物质，常食莼菜具有药食两用的保健作用，是珍贵的水生蔬菜之一。但是由于多年未做有效的品种提纯复壮和品种保护，莼菜种性退化已经比较严重，质量和产量都在下降。目前尚缺乏成熟技术，可以大规模扩繁莼菜优质工程苗，同时克服该物种在自然环境中种源有限且品种逐渐退化的问题。技术实现要素：本发明提供了一种莼菜丛生芽诱导的培养基及诱导方法，该方法是在无菌条件下，采取控温措施，给予固定光照，诱导莼菜丛生芽，逐步成绩无菌苗体系，后期可常年提供大量无菌幼苗。方法易行，操作方便，产量高。为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：一种莼菜丛生芽的诱导方法，包括以下步骤：A、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿、淤泥覆盖少的可萌发腋芽的莼菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，用软毛刷轻轻刷掉表面淤泥至茎段呈绿色，用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，待用；B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡30秒，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入几滴吐温80)进行表面消毒10分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；C、芽诱导：选择1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，活性炭质量浓度为0.4%，pH调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶中；固体培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌后的1-1.5cm的莼菜外植体，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，置于光照培养箱中培养，待幼芽长至2.0-3.0cm进行增殖培养；D、芽增殖培养：选择蔗糖质量浓度3%，活性炭质量浓度为0.4%的MS固体培养基，添加0.5-2.00mg/L6-BA、2-4mg/L2,4-D、0.1-0.50mg/LNAA的激素；培养基分装、培养基灭菌方式与芽诱导相同，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，接入长2.0-3.0cm的幼芽于光照培养箱中，进行增殖培养；所述的步骤C、D均为无菌环境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。优选的，步骤B中，用0.1%氯化汞（加入几滴吐温80）进行表面消毒10min，步骤C中，6-BA的浓度为1.0mg/L，NAA的浓度为0.15mg/L。本发明具有以下有益效果：目前关于莼菜组织培养的技术未见报道，也没有系统的对莼菜作出研究。该技术能直接诱导莼菜幼芽的生长，不断产生丛生芽，为莼菜无菌繁殖体系的建立提供技术攻关。莼菜一年四季均可栽植，尤以春季萌发前移栽成活率最高，又可当年收获，利用本发明可以不受季节、温度、地域影响，获得大量的丛生芽，后期再进行生根培养等，可快速建立莼菜的无菌繁殖体系，为保持莼菜优良的种性提供技术支持，可为广大的养殖户提供源源不断地无菌种苗。一个为长1.5cm的外植体经过一个月的培养芽增殖系数最高可达到8倍。以一个芽30d继代一次，每次的芽增殖系数为8计算，预期结果如下表1所示。表1天数/d3090150210270330360苗数/棵883858789811812附图说明图1是实施例一中莼菜30d增殖情况，图2是实施例二中莼菜30d增殖情况。具体实施方式本发明实施例所使用的试剂，如未特别说明，市售的均可实现本发明，所涉及的技术方案，如未特别说明，均可采用本领域的常规技术。实施例中采用的MS培养基配方如下：单位mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO4•7H2O370KH2PO4170CaCl2•2H2O440MnSO4•4H2O22.3ZnSO4•7H2O8.6H3BO36.2KI0.83Na2MoO4•7H2O0.25CuSO4.5H2O0.025CoCL2.6H2O0.025Na2-EDTA37.3FeSO4•7H2O27.8甘氨酸2.0盐酸吡哆醇0.5盐酸硫铵素0.1烟酸0.5肌酸100。MS固体培养基为上述培养配方中加入7g/L琼脂。实施例一A、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿、淤泥覆盖少的可萌发腋芽的莼菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，用软毛刷轻轻刷掉表面淤泥至茎段呈绿色，用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，待用；B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡30秒，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入几滴吐温80)进行表面消毒10分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；C、芽诱导：选择1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，活性炭质量浓度为0.4%，pH调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶中；固体培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌后的1-1.5cm的莼菜外植体，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，置于光照培养箱中培养，待幼芽长至2.0-3.0cm进行增殖培养；D、芽增殖培养：选择蔗糖质量浓度3%，活性炭质量浓度为0.4%的MS固体培养基，添加0.5mg/L6-BA、4mg/L2,4-D、0.1mg/LNAA的激素；培养基分装、培养基灭菌方式与芽诱导相同，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，接入长2.0-3.0cm的幼芽于光照培养箱中，诱导大量丛生芽；所述的步骤C、D、均采用无菌环境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。本方法可以由一个外植体直接诱导出幼芽，再不断繁殖得到更多的丛芽，30d的增殖系数达到8，存活率大于90%。图1是实施例一中莼菜30d增殖情况。实施例二A、外植体选择与预处理：选择颜色鲜绿、淤泥覆盖少的可萌发腋芽的莼菜茎段作为外植体，用碱性洗涤剂浸泡10min，用软毛刷轻轻刷掉表面淤泥至茎段呈绿色，用自来水冲洗1小时，用蒸馏水反复冲洗4-5次，用无菌水再反复清洗4-5次，待用；B、外植体灭菌：在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡30秒，用无菌水冲洗4-5次，再用0.1%氯化汞(加入几滴吐温80)进行表面消毒10分钟，无菌水冲洗4-5次，在无菌滤纸上将水吸干，待用；C、芽诱导：选择1.0mg/L6-BA和0.15mg/LNAA的MS固体培养基，蔗糖质量浓度为3%，活性炭质量浓度为0.4%，pH调至5.8-6.0，固体培养基装于组培瓶中；固体培养基经过120℃灭菌处理20min，冷却后，接入灭菌后的1-1.5cm的莼菜外植体，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，置于光照培养箱中培养，待幼芽长至2.0-3.0cm进行增殖培养；D、芽增殖培养：选择蔗糖质量浓度3%，活性炭质量浓度为0.4%的MS固体培养基，添加2.00mg/L6-BA、2mg/L2,4-D、0.50mg/LNAA的激素；培养基分装、培养基灭菌方式与芽诱导相同，加入无菌水超过固体培养基面3-4cm，接入长2.0-3.0cm的幼芽于光照培养箱中，进行增殖培养；所述的步骤C、D均采用无菌环境，光照60-70μE/（m2·s），光照周期为12h/d，室内温度（25±2）℃。本方法由一个外植体直接诱导出幼苗，30d的增殖系数可以达到6倍，存活率大于85%。图2是实施例二中莼菜30d增殖情况。本发明采用现代生物技术手段，对莼菜进行组织培养诱导丛生芽，逐步建立快速繁殖无菌体系，使优良品种能迅速推广种植，生产成本低，培养周期短，实现工厂化生产的目的，具有广阔的应用前景和较高的推广价值，经济效益显著。当前第1页1 2 3