本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及苗族药材青荚叶的快速繁殖方法。
背景技术：
苗族药材枪墙叶即青荚叶(Helwingia japonica.japonica)，为山茱萸科青荚叶属落叶灌木。青荚叶属有青荚叶、中华青荚叶、西藏青荚叶、浙江青荚叶和峨眉青荚叶等5种，主要分布于亚洲东部的尼泊尔、锡金、不丹、印度北部、缅甸北部、越南北部、中国和日本等国。我国5种均产，主要分布于陕西、河南、长江流域及华南地区等海拔1500米以上的原始森林中。由于青荚叶雌花无梗，花和果实在叶面中央的主脉上生长，又被称为叶上花或叶上果。其根茎叶入药，具有舒筋活络、调经、止咳等功效，苗族民间常以叶上花、无花果、月季花搭配治疗月经不调,以叶上花、矮陀陀、土三七搭配治疗劳伤,单独使用青荚叶来治疗年久咳喘。此外，青荚叶为落叶小灌木，雌雄异株，雌株的花和雄株的果均具有很强的直观性，这种奇特的现象总能吸引路人的驻足观赏。景观配置上，种植在阴湿肥沃处，如配植紫丁香、垂丝海棠树下，或种植于水塘、墙边或台阶前，或盆栽于室内，均有良好的观赏效果。
目前，青荚叶尚处于引种阶段，少量栽培于贵州、广西苗族地区。青荚叶主要采用种子繁殖，但由于其种子常被鸟类采食，难以获得足够用于繁殖的种子。因此，为了解决青荚叶规模化种植中其种苗缺乏的问题，有必要建立青荚叶的组织培养快繁体系，本发明选择青荚叶带节茎段为外植体，经不定芽诱导培养、继代培养、生根培养以及移栽等步骤，实现了苗族药材青荚叶的快速繁殖。本发明具成本低、工艺简单、成苗快等特点，可直接用于青荚叶种苗的工厂化生产，对于青荚叶的遗传改良和种质资源保护具有重要的现实意义。
目前，国内外尚未有青荚叶组织培养技术的报道，也未有青荚叶组培快繁专利的申请。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种苗族药材青荚叶的快速繁殖方法，本发明选择青荚叶带节茎段为外植体，经不定芽诱导培养、继代培养、生根培养以及移栽等步骤，实现了苗族药材青荚叶的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种苗族药材青荚叶的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：获取青荚叶的外植体、不定芽诱导、不定芽的继代培养、不定芽的生根培养、试管苗移栽；
所述的不定芽诱导的诱导培养基包括：MS培养基、0.5～1.0mg/L ZT、0.1～0.3mg/L NAA、25～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，所述的不定芽诱导的方法为：将青荚叶的外植体经清洗消毒处理后切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到诱导培养基中，在25～28℃进行全暗培养25～30天即可诱导形成不定芽。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，不定芽的继代培养所用的继代培养基包括：MS培养基、0.5～1.0mg/L 6-BA、0.1～0.5mg/L NAA、20～30g/L蔗糖、3.5～4.0g/L琼脂、0.1～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，所述的不定芽的继代培养的方法具体为：将经过不定芽诱导得到的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到继代培养基中培养25～30天即可实现不定芽的继代。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，不定芽的生根培养所用的生根培养基包括：1/2MS、0.1～0.3mg/L 6-BA、0.1～0.3mg/L IBA、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，所述的不定芽的生根培养的方法为：将经过不定芽的继代培养得到的长约2.0～3.0cm的不定芽从基部切取并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，所述的试管苗移栽的方法具体为：将经过不定芽的生根培养得到的生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1～3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，所述的不定芽诱导、不定芽的继代培养的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2000～2500lx，光照时间为10～12小时/天。
在上述的苗族药材青荚叶的快速繁殖方法中，获取青荚叶的外植体的具体方法为：在野外选取生长健壮、无病害的青荚叶植株的带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理。
有益效果：
本发明利用植物组织培养技术实现了苗族药材青荚叶的快速繁殖，本发明具成本低、工艺简单、成苗快等特点，成活率达到91％以上，可直接用于青荚叶种苗的工厂化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无病害的青荚叶植株的带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先用10％的洗衣粉溶液清洗3次后，在自来水下冲洗20分钟后置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒15秒钟，无菌水冲洗2次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中，在25℃进行全暗培养25天即可诱导形成不定芽，诱导率为82.8％，污染率低于20％。所述的不定芽诱导培养基为：MS培养基+1.0mg/L ZT(玉米素)+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.4。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到继代培养基中培养25天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到7倍。所述的继代培养基为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4。
(4)生根培养：将步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的不定芽从基部切取并接种到生根培养基中培养25天即能实现试管苗的生根，生根率为89.5％。所述的生根培养基为：1/2MS+0.3mg/L 6-BA+0.3mg/L IBA+1.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂，pH为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗1天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为91.8％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无病害的青荚叶植株的带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先用10％的洗衣粉溶液清洗4次后，在自来水下冲洗25分钟后置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒23秒钟，无菌水冲洗2次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒24分钟，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中，在27℃进行全暗培养27天即可诱导形成不定芽，诱导率为81.3％，污染率低于15％。所述的不定芽诱导培养基为：MS培养基+0.8mg/L ZT(玉米素)+0.2mg/L NAA+23g/L蔗糖+3.7g/L琼脂+0.7g/L活性炭，pH为5.6。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到继代培养基中培养27天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到6倍。所述的继代培养基为：MS培养基+0.7mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.7g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.6。
(4)生根培养：将步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的不定芽从基部切取并接种到生根培养基中培养28天即能实现试管苗的生根，生根率为90％。所述的生根培养基为：1/2MS+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.8mg/L NAA+17g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.6。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗2天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为93％。上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为2700lx，光照时间为11小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无病害的青荚叶植株的带节茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)不定芽诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先用10％的洗衣粉溶液清洗5次后，在自来水下冲洗30分钟后置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中，在28℃进行全暗培养30天即可诱导形成不定芽，诱导率为80.9％，污染率为9.2％。所述的不定芽诱导培养基为：MS培养基+0.5mg/L ZT(玉米素)+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+1.0g/L活性炭，pH为5.8。
(3)继代培养：将步骤(2)诱导得到的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到继代培养基中培养30天即可实现不定芽的继代，增殖系数达到5倍。所述的继代培养基为：MS培养基+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
(4)生根培养：将步骤(3)继代得到的长约2.0～3.0cm的不定芽从基部切取并接种到生根培养基中培养30天即能实现试管苗的生根，生根率为86.1％。所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+0.5mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)根系生长良好的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1的腐殖土、树皮混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为93.7％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2500lx，光照时间为12小时/天
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。