一种茄子单倍体植株加倍方法与流程

本发明属于植物育种或组织培养领域，具体涉及一种茄子单倍体植株加倍方法。

背景技术：

茄子(solariummelongenal)，原产亚洲热带，我国各省均有栽培。草本或亚灌木状，果可供蔬食，根、茎、叶、种子皆可入药。

近年发展起来的以组织培养和遗传工程为主导的生物技术,为缩短育种年限开辟了一条新途径。70年代初,riana等成功地通过茄子花药培养经愈伤组织途径成苗，目前不论是茄子花药还是花粉(小孢子)培养，都已有许多成功的报道，但国内利用花药或花粉培养获得的亲本，选育出茄子新品种的报道却并不多。究其原因，主要是茄子花药或花粉培养产生再生植株的频率不高，且再生植株中的单倍体加倍频率不高，成熟的单倍体植株加倍困难。一般加倍方法是：采用一定浓度的秋水仙素溶液，处理比较幼嫩植株的生长点一定时间，成功的报道国内仅见于北京市农科院蔬菜所单倍体组，其加倍处理后的植株结实率最高的可达到87.5％，但加倍前植株是否均为单倍体，以及结实植株是否为二倍体则并未说明。笔者在加倍方法研究过程中，也采用了秋水仙素溶液滴生长点的处理方法，处理后枝条要么死亡，要么没有加倍成功，与其他茄子育种单位交流，普遍反应茄子单倍体植株处理生长点诱导加倍比较难以成功。

除了活体植株生长点诱导加倍方法外，组培过程中诱导生根苗或无根幼苗加倍、秋水仙素浸幼苗根或分蘖节法等也是常用的方法，但这些常用方法均存在同样的问题：一旦处理过程中造成苗死亡，则非但单倍体不能成功加倍，而且原有单倍体材料也会丢失。本发明在此基础上，对茄子单倍体植株开展离体诱导枝条加倍的技术研究，在保存原始材料的同时进行加倍，保证每一单倍体植株加倍成功，提高了茄子花药(粉)培养技术应用于育种实践的效率。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种茄子单倍体植株加倍方法，以解决现有技术存在的效果不佳等问题。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种茄子单倍体植株加倍方法，它包括如下步骤：

(1)采集单倍体茄子植株枝条，将基部约2cm浸入多菌灵溶液，再转入秋水仙素溶液中进行加倍处理；

(2)取步骤(1)中加倍处理后的枝条用水冲洗后，将基部剪成45度斜面，浸入iba溶液中，再插入基质中；

(3)将步骤(2)中插入基质中的枝条用塑料薄膜密封后，进行光照培养，15～20天后即得加倍后的茄子扦插苗。

步骤(1)中，所述的单倍体茄子植株枝条的采集方法为：当单倍体茄子植株发育到四门斗开花时，将双干整枝留下的四个枝条，从分叉处向上留2-4片叶剪掉，待隐芽萌出的枝条达到10cm左右时，将枝条从底部剪下。

步骤(1)中，所述的多菌灵溶液由有效成分含量为50wt％的多菌灵可湿性粉剂与水按照1：500～800的质量比稀释得到；将基部浸入多菌灵溶液，浸泡时间为0.5～4h，优选0.5～2h。

步骤(1)中，所述的秋水仙素溶液的浓度为0.05～0.5wt％，所述的加倍处理的方法为将枝条基部浸入秋水仙素溶液中4～72h。

其中，优选的是，秋水仙素溶液的浓度为0.05wt％，浸泡时间为72h；或者秋水仙素溶液的浓度为0.2wt％，浸泡时间为5h。

步骤(2)中，所述的iba溶液的浓度为500～1000ppm，枝条基部2cm在iba溶液中的浸泡时间为1～10s。

步骤(2)中，所述的基质为蛭石或由蛭石、草灰和珍珠岩以5：4：1的体积比混合而成，厚度不小于10cm，浇透但不积水。

步骤(2)中，在基质中，枝条的插入深度为3～4cm，倾斜角度为30度，株行距为8cm。

步骤(3)中，所述的光照培养的温度为24～26℃，光周期为12～16h，暗周期为8～12h，光照强度为1000～1500lx。

步骤(3)中，前两周内不打开薄膜，两周后可打开薄膜，拔除未生根枝条并浇水后，重新盖好薄膜。

植株倍性鉴定及二次加倍处理：植株倍性鉴定采用分裂过程中染色体计数的方法，二倍体植株体细胞染色体数目为24条，花药中花粉量多，人工辅助自交后，多数能够结果并产生种子。

未加倍成功的植株，可以从原始单倍体植株上采集枝条再进行加倍处理，或从加倍未成功的单倍体上采集枝条进行二次加倍处理，直至该植株加倍成功为止。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

应用本发明方法，所保存的单倍体植株均加倍成功，扦插成活的加倍植株可迅速进入生殖生长，开花结果并得到了自交种子。扦插结合加倍，对茄子单倍体植株进行了有效的保存、研究和利用。利用本发明方法，枝条成活率在夏季污染严重季节可以达到10％以上，成活株加倍率可达50％至100％

附图说明

图1为234号单倍体植株及其根尖细胞(12条染色体)；

图2为234加倍处理后结果的二倍体植株及其花粉母细胞(中期ⅰ，12个二价体，2n＝24)；

图3为水培扦插保存的84-2单倍体植株及其根尖细胞(2n＝12)；

图4为84-2加倍处理后结果的二倍体植株及其根尖细胞。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

试验于2016年8月8日开始，在金陵科技学院遗传育种实验室中进行。单倍体植株编号为84-2和234，分别是2015年和2016年花药培养获得的茄子单倍体植株，其中84-2为枝条扦插成活而保存的植株。50％wp多菌灵粉剂为上海悦联化工有限公司生产，其有效成分含量为50wt％，每升自来水中含有1.25克粉剂，配置成为稀释800倍的混悬液；秋水仙素粉剂(分子量为399.49)为sigma公司原产分装，秋水仙素粉剂用超纯水直接溶解，配置成0.05wt％和0.2wt％两种浓度的溶液；吲哚-3-丁酸(iba,分子量为203.24)，由中国医药集团上海化学试剂公司生产，粉剂先用少量100％酒精溶解，再用超纯水稀释到1000ppm。

1.采集单倍体植株上的枝条：当234号和84-2号单倍体植株发育到四门斗开花时，将双干整枝留下的四个枝条，从分叉处向上留2-4片叶剪掉，待隐芽萌出的枝条达到10cm左右时，将枝条从底部剪下，立即放入多菌灵(50％粉剂)800倍水溶液中；234号共10个枝条，84-2共20个枝条。

2.扦插前枝条处理和扦插基质准备：将枝条在50％多菌灵800倍液中，室温下浸泡2h后取出，晾干或吸干基部液体，再转入秋水仙素溶液中进行加倍处理。

在枝条浸泡处理过程中准备好扦插基质，基质采用保湿效果好的纯蛭石，装入不透水的塑料箱内，厚度10cm以上，浇透但不积水，备用。

3.秋水仙素加倍处理：加倍处理有低浓度溶液长时间处理和高浓度溶液短时间处理两种方法，分别为0.05％秋水仙素溶液浸泡枝条下部72h，和0.2％秋水仙素溶液浸泡处理5h。

4.枝条扦插：自来水冲洗加倍处理过的枝条，用锋利的修枝剪等将基部剪成45度斜面，顶端剪平或不剪。将修剪过的枝条基部斜面浸入1000ppm的iba溶液中，1-10s后取出，向前方倾斜30度，插入基质中，株行距约8cm，深度达到3-4cm，扦插完后淋一遍小水，注意基质中不能积水。

5、覆盖保湿：用塑料薄膜将塑料箱盖严，然后整个放入光照培养箱中，光照培养箱温度设定为25℃，光暗周期12h/12h，光照强度调整为1500lx。

6.扦插后管理：扦插后2周内不开膜，2周后打开塑料膜，观察统计成活率。生根成活的枝条不腐不蔫不干，部分枝条上的芽有一定量的生长，死亡的枝条则干缩萎蔫。将未生根枝条拔除，并根据基质干湿情况适当浇小水，重新盖好薄膜，与培养箱顶端之间留约1cm宽缝隙，并在保证植株不萎蔫的基础上逐步加大缝隙宽度，直至揭除薄膜。最后将成活的扦插苗移栽到大盆内或田间，按照正常栽培管理即可。

6.植株倍性鉴定及二次加倍处理：当成活的加倍处理植株现蕾开花后，对植株叶形指数、花蕾宽度、有无花粉，以及是否坐果等进行观察，并采摘加倍处理后的植株上的花蕾进行减数分裂过程中染色体计数，以鉴定植株的倍性，结果见表1。二倍体植株体细胞中染色体数目为24条，花药中花粉量多，人工辅助自交后，多数能够结果并产生种子。

表1234和84-2枝条加倍处理结果