本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法。
背景技术：
微斑报春苣苔(Primulina minutimaculata)为苦苣苔科报春苣苔属的多年生草本植物。分布于广西龙州、天等，生于石山林下石上，海拔200-450m，花期4-5月。微斑报春苣苔在龙州和天等的分布范围虽然较广，但分布零星，且居群小，植株个体数量较少，自身更新困难。此外，由于开山筑路等对生境严重破坏，导致居群迅速退缩，目前已处于濒危状态，IUCN等级为极危。
微斑报春苣苔花型独特，叶片具有魅力的斑纹，观赏价值极高，受到国外众多观赏植物爱好者和育种者的广泛关注，是极具开发利用的喀斯特野生花卉。传统的繁殖以种子播种和叶片扦插为主，但繁殖速度慢，繁殖系数小。而组织培养能够在短时间内获得大量遗传性状一致的优质苗，克服了常规繁殖周期长、繁殖系数小的缺点。
目前，组织培养在报春苣苔属的其他植物上得到了广泛应用，且多以叶片为外植体，而在微斑报春苣苔上的应用尚未有报道。因此，通过微斑报春苣苔的种子无菌萌发进而进行分化培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，从而建立微斑报春苣苔的组织培养体系，对其规模化生产和种质资源收集及保存具有积极意义。
技术实现要素：
针对现有的微斑报春苣苔人工繁育技术的匮乏与不足，本发明提供一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，该方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：
(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10-15min后在流水下冲洗干净10-15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30-40s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12-15min，无菌水冲洗3-5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代培养：将已经萌发子叶但尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28-32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；
(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26-28d；
(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29-30d；
(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23-25d；
(6)炼苗移栽：将具有2-3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10-14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40-50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率。
作为优选，步骤(1)中所述的暗培养的温度为17-20℃；所述的光培养温度23-25℃，光照为1000-1400lx。
作为优选，步骤(1)中所述的萌发培养基以MS+GA31.0-2.0mg/L+活性炭0.5g/L。
作为优选，步骤(2)中用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT 1.0-2.0mg/L+NAA 0.01-0.1mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.1-1.0mg/L+2,4-D 1.5-2.0mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0mg/L。
作为优选，步骤(3)中所述的增殖培养基以MS+6-BA1.0-3.0mg/L+IBA0.1-0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L。
作为优选，步骤(4)中所述的分化培养基为MS+ZT0.1-1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L。
作为优选，步骤(5)中所述的生根培养基为1/2MS+IBA1.0-3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L。
作为优选，所述1/2MS培养基为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致。
作为优选，步骤(6)中所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成。
作为优选，步骤(6)中所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的微斑报春苣苔的组织培养方法具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的组培苗，是微斑报春苣苔种苗生产及资源保护的有效途径。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1：
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：
(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗10min后在流水下冲洗干净10min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚12min，无菌水冲洗3次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的暗培养的温度为17℃；所述的光培养温度23℃，光照为1000lx；所述的萌发培养基以MS+GA3 1.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代培养：将已经萌发子叶尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶28d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.1mg/L+2,4-D 1.5mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.1mg/L+2,4-D 1.5mg/L；
(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养26d；所述的增殖培养基以MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29d；所述的分化培养基为MS+ZT 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养23d；所述的最佳生根培养基为1/2MS+IBA 1.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培养基为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致；
(6)炼苗移栽：将具有2对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗10d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为40％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率；所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成；所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。
实施例2：
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：
(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗15min后在流水下冲洗干净15min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚40s，无菌水冲洗5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚15min，无菌水冲洗5次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的暗培养的温度为20℃；所述的光培养温度25℃，光照为1400lx；所述的萌发培养基以MS+GA3 2.0mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代培养：将已经萌发子叶尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶32d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 1.0mg/L+2,4-D 2.0mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU1.0mg/L+2,4-D2.0mg/L；
(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养28d；所述的增殖培养基以MS+6-BA3.0mg/L+IBA0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养30d；所述的分化培养基为MS+ZT1.0mg/L+IBA0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养25d；所述的最佳生根培养基为1/2MS+IBA3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培养基为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致；
(6)炼苗移栽：将具有3对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗14d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为50％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率；所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成；所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。。
实施例3：
一种微斑报春苣苔的无菌播种和组织培养方法，包括如下步骤：
(1)种子的无菌萌发：取成熟未开裂的微斑报春苣苔的果荚，用洗洁精浸洗13min后在流水下冲洗干净13min，在超净工作台上先用75％酒精中浸泡果荚35s，无菌水冲洗3-5次，再用0.1％升汞溶液浸泡果荚14min，无菌水冲洗4次，在接种盘上切开果荚，并用经过消毒灭菌的勺子轻轻将种子拨入种子萌发培养基中，播种好的种子先在光照培养箱中暗培养至种子萌发，然后再转入培养室中光培养；所述的暗培养的温度为18℃；所述的光培养温度24℃，光照为1200lx；所述的萌发培养基以MS+GA3 1.5mg/L+活性炭0.5g/L；所述的0.1％升汞溶液中加入有吐温-20，每100mL0.1％升汞溶液中加入2滴吐温-20；
(2)初代培养：将已经萌发子叶尚未长出真叶的小苗切成子叶、胚轴两部分，然后接入不同的初代培养基中；子叶30d可直接诱导出不定芽，并且在子叶基部有愈伤组织产生；胚轴30d能诱导愈伤组织；用于子叶的不定芽诱导培养基为MS+KT 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L，愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.6mg/L+2,4-D 1.8mg/L；用于胚轴的愈伤组织诱导培养基为MS+CPPU 0.3mg/L+2,4-D 1.8mg/L；
(3)不定芽的增殖培养：将具有1对以上叶片的不定芽切取下来，接入增殖培养基中培养27d；所述的增殖培养基以MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(4)愈伤组织的分化培养：将愈伤组织切成1cm×1cm的小块接入分化培养基中培养29-30d；所述的分化培养基为MS+ZT 0.4mg/L+IBA 0.2mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+苹果20g/L+椰汁100ml/L；
(5)生根培养：当组培芽具有2对以上叶片时，转接于生根培养基中培养24d；所述的最佳生根培养基为1/2MS+IBA 2.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L；所述1/2MS培养基为：将MS培养基中的大量元素减至一半，蔗糖为15g/L，其余成分及用量与MS保持一致；
(6)炼苗移栽：将具有2对叶片的生根苗移出培养室，在温室中炼苗12d；洗净培养基移栽到装有基质的50孔穴盘中，浇透定根水后，将移栽小苗置于有遮阳网的荫棚下，透光率为45％，移栽7d后，用1/2MS营养液浇淋，连续淋2次，时间间隔为7d，移栽后20d后统计成活率；所述的基质由泥炭和粗沙按照体积比为2:1组成；所述的1/2MS营养液为MS培养基中的大量元素减半，其余成分及用量与MS保持一致，不添加蔗糖和琼脂。。
将上述实施例1-3得到的微斑报春苣苔的组织培养方法中种子萌发率、不定芽诱导、愈伤组织诱导、增殖培养、分化培养、生根情况以及组培苗的移栽成活率进行调查统计，结果见表1。
表1本发明的微斑报春苣苔的组织培养方法对种子萌发、不定芽诱导、愈伤组织诱导、不定芽的增殖、愈伤组织的分化以及生根情况的测定
由表1可知，本发明的微斑报春苣苔的组织培养方法得到的不定芽长势良好，不定芽多；其生根率为100％，组培苗的移栽成活率为100％。可见，本发明的方法具有明显的技术优势，值得进一步推广和应用。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。