一种利用诱导剂提高棉花黄萎病抗性的方法与流程

本发明涉及一种提高棉花黄萎病抗性的方法，具体地说是涉及一种利用诱导剂提高棉花黄萎病抗性的方法。

背景技术：

棉花是我国重要的经济作物，是国防、纺织、化工等行业的主要原料之一。然而，棉花的病虫害一直限制棉花种植业的发展，特别是黄萎病，素有棉花“癌症”之称，对棉花的产量和质量造成重大负面影响。

目前提高棉花黄萎病抗性的方法有很多，其中利用枯草杆菌或者芽孢杆菌等微生物制剂合并化学制剂喷施可提高抗病性，但是大量使用农药对环境造成污染，破坏农田的生态平衡。专利cn1397166a公开了利用质量分数为80%乙酰水杨酸与20%硼砂混合后与水配成1：1000的溶液进行棉花叶面喷施，利用中医的方法对已经感病的棉花植株进行治疗。然而，棉花的黄萎病菌从根部接菌，到植株叶片表现出枯萎、枯黄等可见的症状一般需要10天左右的时间，在这期间，大量致病毒素已经通过维管束扩散至整株。

此外，利用抗病相关基因对棉花进行转化也是提高棉花黄萎病抗性的一种方法，但是棉花转基因具有基因型限制，现今没有通过转抗病基因提高黄萎病抗性的棉花品种用于生产。水杨酸（sa）是一种小分子酚类物质，广泛存在于植物的叶片和繁殖器官中，其在棉花抗逆、低温出苗、种衣剂等方面应用广泛，但尚未有将水杨酸作为诱导剂提高棉花抗病性，并提出精确诱导时间、喷施时间的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种利用诱导剂提高棉花黄萎病抗性的方法，以解决现有体高棉花黄萎病抗性的方法污染环境、仅针对感病植株等问题。

本发明的目的是这样实现的：

一种利用诱导剂提高棉花黄萎病抗性的方法，采用浓度为0.5~10mmol/l的水杨酸溶液为诱导剂，所述sa溶液与黄萎病诱导的npr1抗病表达模式一致，在出现黄萎病的前三天采用sa溶液喷施棉花叶片，以获得较佳黄萎病抗性。

所述诱导剂为0.5mmol/l的水杨酸溶液。

在第一次喷施sa溶液之后，每隔3~5天再喷施一次sa溶液，以维持棉苗体内的抗病水平。

本发明采用水杨酸作为诱导剂诱导变化产生抗黄萎病抗性，经水杨酸处理后减少了病原菌对棉苗的伤害，并且在第一次喷施处理sa后，每隔3~5天再喷施一次sa溶液，可维持棉苗体内的抗病水平。在田间黄萎病爆发高峰的6月20日与8月20日前10~15天喷施sa溶液，为提高抗病性的较佳时间。

本发明提高棉花黄萎病抗性的方法简单、成本低廉，提高棉花黄萎病抗性的效果良好，具有一定的应用前景。

附图说明

图1是npr1.1基因在不同浓度水杨酸溶液处理下的表达情况柱状图。

图2是npr1.1基因在黄萎病菌接菌处理下的表达情况柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。下述实施例均实现了本发明的目的。

1.材料的来源

供试棉花种子为冀228，种子由河北省农林科学院棉花研究所提供。

2.棉苗培育

选取大小基本一致的饱满的脱绒种子，37度温水浸泡过夜，露白后，放置于双层滤纸上，在种子盒中发芽1天。选取发芽长度一致的种子，播种于塑料营养钵，基质为蛭石。浇灌hoagland营养液，置于人工气候箱中培养，温度28℃/18℃，相对湿度70%，光照16h/黑暗8h条件下培养3周。实验设0、0.5mmol/l、2mmol/l三个水杨酸（sa）处理浓度。每个处理播种20盆，每盆播5粒，待棉苗三叶期时，供sa喷洒处理。

3.孢子悬浮液的制备

将河北省农林科学院植物保护研究所提供的vlx2-1保存于-70℃的黄萎病菌孢子液涂于pda平板上，在25℃条件下暗培养活化一周。用接种针取活化后的边缘菌块并用灭菌水震荡悬浮，然后取1ml菌液平铺到新的pda平板上。五天后用灭菌水从平板上洗下孢子，并将浓度调至105spores/ml。

4.sa与黄萎病菌诱导下抗病相关基因的表达模式分析

分别采用0、0.5、2、5、10mmol/l水杨酸（sa）喷施三叶期的棉苗，在经喷施处理后0h、1h、2h、24h、48h、96h、120h提取叶片rna，反转录后对gbnpr1.1基因进行荧光定量pcr检测。上述处理均设置三次重复。

图1示出了npr1.1基因在不同浓度sa处理下的表达情况。图1中的结果表明，sa喷施浓度0.5mmol/l与2mmol/l时，与对照相比均提高了gbnpr1.1的表达量，但两种处理浓度间差异不显著，gbnpr1.1基因的表达量随处理时间延长逐渐增加，96h表达量达到峰值，120h后基因的表达量有所下降。由此可见，sa与黄萎病菌对gbnpr1.1基因的诱导表达模式相似。

5.喷施处理

将棉花种子发芽，种植于25℃温室内，在光照16h/黑暗8h条件下培养3周，取浓度为0.5mmol/l的sa溶液均匀喷施在棉花叶片上，以叶片上形成均匀的液滴不滴落为宜。

6.接菌处理

经0.5mmol/l的sa溶液喷施处理3天后，小心拔出幼苗，将根部浸入孢子悬浮液1min，在光照16h/黑暗8h条件下培养，保持土壤湿度在50%以上。每次喷施100棵长势基本一致的棉苗，重复3次。间隔5天重复喷施1次，连续调查20天。以不喷洒sa溶液，但采用黄萎病菌接菌的为对照ck。

7.喷施效果确定

在接菌后10天左右开始调查各个接种单株的病级，以后每2天重新调查一次，棉花黄萎病鉴定分级标准如表1所示，根据调查结果计算各单株的病情指数（di）。

表1棉花黄萎病鉴定分级标准

病情指数的计算公式为：

∑病情指数（di）=σ(发病级数×该级株数)÷(最高发病级数×调查总株数)×100

表2示出了接菌20天发病指数的调查结果。从表2中可以看出，喷施sa的棉苗平均病情指数为18.5，病指达到抗病水平，未喷施sa的棉苗平均病情指数为38.5，病指为感病。

表2接菌后20天发病指数调查结果

图2示出了npr1.1基因在黄萎病菌接菌处理下的表达情况。采用荧光定量pcr技术，检测喷施不同浓度的水杨酸溶液后，npr的表达量在96h前呈现上升趋势，在96h达到最高。因此，96h为较佳处理时间。

综上，在接种黄萎病菌前3天喷施0.5mmol/l的sa溶液为诱导棉花获得较佳抗性的时间。由于5天后抗病基因的表达量逐渐下降，为维持较高的抗病性，建议之后可以每隔5天喷施一次有利于维持植物体内较高的抗病水平，对第一次的诱导效果起到加强作用。在此基础上，在田间黄萎病爆发高峰的6月20日与8月20日前10~15天为喷施sa提高抗病性的较佳时间。由此引申，间隔3-5天追加喷施sa，也是对保持棉花自身的系统获得抗性是有利的。