本发明涉及树莓组织培养技术领域，尤其是一种诱导树莓愈伤组织形成球形胚的方法。
背景技术：
树莓作为新兴的功能性水果，因其营养丰富，越来越受到消费者的欢迎，市场的需求也变得越来越大。随着树莓的种植面积的扩大，对树莓的种源要求也变得多样化，因此加快树莓的育种研究变得十分紧迫。
树莓多为野生品种，经过人工选育获得的栽培品种，是遗传相对稳定的植物品种，通过常规的杂交，很难获得新的优良性状，常规育种发展遇到瓶颈。而基因转化技术又受到市场的制约，不能产业化，因此，目前树莓的育种基本采用诱变技术。常规的物理及化学诱变多采用种子或植株，诱变效率极低，采用胚性愈伤组织进行诱变育种，可以大大提高诱变效率。但由于胚性愈伤组织诱导较为困难，如何提高胚性化细胞的诱导率是极需解决的问题。
据检索，没有发现有关树莓体细胞胚诱导方面的文献和专利，关于饥饿处理诱导胚性愈伤组织文献也很少，但发现诸多关于树莓营养繁殖和其他植物激素诱导体细胞胚的文献，具体公开内容可总结几类如下：
1、文献2005年许欣然等在河南农业科学发表的《棉花优良品种中棉所27直接胚胎发生与植株再生》一文中提到了“饥饿处理”，但这里的饥饿处理是指外植体在培养基(ms无机盐+b5维生素)诱导下形成的愈伤组织少或无愈伤组织，不转瓶接着培养，这里的饥饿处理只是没有添加激素，实际上是有营养的，和本发明使用的无菌水是完全不一样的。
2、文献2004年甘肃农业大学李尚中的硕士论文《小麦幼胚高频再生及外源dna电击转化体系的研究》一文中提到了“低温(3-4℃)饥饿处理”，是将小麦的幼胚用湿纱布包住置于3-4℃冰箱中处理0天、3天、7天、14天、20天和30天，再接种于诱导培养基上诱导愈伤组织和胚性愈伤组织。此方法有低温和饥饿两个条件，但最主要的是低温的影响，没有接种到培养基上的幼胚外植体，外源营养对其无作用。
3、文献2007年东北林业大学张宇的硕士论文《水曲柳体细胞胚胎发生的同步化调控》一文中提到了“饥饿法”，是指将具有早期原胚的外植体转移到无微量元素和维生素的培养基是进行饥饿培养。此饥饿处理的方法是针对营养繁殖的，和本发明的诱导胚性愈伤组织无关系。
4、文献2013年扬州大学杨绪清的硕士论文《碳源对黄瓜愈伤组织糖代谢相关酶的调控》中提到了“饥饿法”，是将愈伤组织转移到无糖的培养基中进行培养，然后进行愈伤组织各种可溶性糖含量的测定，和本发明的诱导胚性愈伤组织无关系。
5、文献申请号：03104794.7发明了一种树莓苗木组织培养繁殖方法；文献申请号：200810246902.8发明了一种细胞培养繁殖树莓的方法；文献申请号：200910095104.4发明了一种红树莓的组织培养与快速繁殖方法；文献申请号：201410258289.7发明了一种美国红树莓苗的无激素培养及快速繁殖方法；文献申请号：201410250093.3，发明了一种通过组织培养繁育树莓苗的方法。以上发明方法是将树莓外植体依次接种于培养基、增殖培养基和生根培养基中培养，再将生根苗移到大棚，可以获得大量无性繁殖的组培苗。这些仅仅是关于树莓品种营养繁殖的方法，与本发明所涉及的树莓体细胞再生方面的研究完全不同。
6、文献申请号：201510443187.7发明了一种楸树的体外培养方法；文献申请号：201611193740.7发明了一种诱导重楼未成熟合子胚产生体细胞胚的组织培养方法；文献申请号：201610341816.x，发明了一种板栗的体细胞胚的诱导方法；文献申请号：申请号201510771278.3发明了一种提高红松胚性愈伤组织诱导率和转胚率的方法；文献申请号：201610960985.1发明了一种连香树的体外培养方法。以上发明方法应用的外植体或是合子胚或是幼胚等，再分别将外植体依次置于愈伤组织诱导培养基、增殖培养基、诱导培养基、分化培养基、再生培养基等诱导体胚萌发，得到实生苗。与本发明外植体选择的材料不同，使用的诱导方法不同。
7、文献申请号：201610888281.8发明了一种山葡萄体细胞胚及其培养方法、培养基及应用；文献申请号：201610426774.x发明了一种浙江红花油茶的体胚快繁育苗方法；文献申请号：201610560228.5，发明了一种北五味子的扩繁方法。以上发明方法主要是通过调整激素配方形成不同阶段的培养基，将外植体依次诱导出愈伤组织、胚性愈伤组织及体细胞胚，但大都没有提到诱导率或是诱导率不高。与本发明使用的诱导方法不同，获得的诱导率不同。
8、文献申请号：201610163915.3发明了一种绒毛白蜡离体叶片体胚诱导培养基，诱导率可达79％；文献申请号：201610038247.1发明了一种高效诱导杂种檀香体细胞胚胎发生与植株再生的方法，诱导率可达80％以上；文献申请号：201610017997.0发明了一种国槐离体叶片体细胞胚诱导的快速繁殖方法，诱导率可达80％以上；文献申请号：201510939742.5一种梨树离体叶片体细胞胚诱导快繁培养方法；文献申请号：201510779403.5发明了一种海桐体细胞胚胎发生和植株再生的方法；文献申请号：201610727969.8，发明了一种无患子体细胞胚同步化的悬浮培养方法，诱导率达到95％。以上发明方法主要是将将外植体直接诱导成胚性愈伤组织，再转接于其他阶段的培养基中进行体细胞胚的培养，使用的是激素诱导的方法，与本发明饥饿处理的方法不同。
9、文献申请号：201610455479.7发明了一种荷花未成熟子叶体细胞胚胎发生途径的再生方法；文献申请号：201610293458.x，本发明提供了一种皇冠草人工种子制备方法；文献申请号：201610143917.6发明了一种牡丹组织培养再生的方法；文献申请号：201510476557.7发明了一种短距槽舌兰快速繁殖方法；文献申请号：201410332223.8发明了一种露地菊‘火焰’间接体细胞胚快速诱导方法；文献申请号：201610533011.5，发明提高了辣椒体细胞胚发生的频率。以上发明方法大多将外植体接种到到体细胞胚诱导培养基上直接诱导出体细胞胚，但主要是针对草本植物，而本发明是木本植物，所用的诱导方法也不同。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种诱导胚性愈伤组织，诱导率高，由诱导胚性愈伤组织培养球形胚，诱导率高的一种诱导树莓愈伤组织形成球形胚的方法。
本发明采取的技术方案是：
一种诱导树莓愈伤组织形成球形胚的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
步骤1：剪取树莓无菌苗两叶片间的茎段作为外植体，接种到愈伤组织诱导培养基上，得到树莓的松散型愈伤组织；
步骤2：取培养好的松散型愈伤组织，接种到只有无菌水的无菌培养皿中，进行饥饿诱导培养，得到胚性愈伤组织；
步骤3：将所述胚性愈伤组织接种到ms培养基中，进行胚状体培养，得到球形胚。
本方法中，所述步骤1中，愈伤组织培养基为1/2ms+0.5-1.0mg/l2,4-d+100mg/lvc+20g/l蔗糖，ph值5.8；所述步骤1中，愈伤组织培养条件为23-25℃，光照时间12小时，光照强度为500-1000lux，培养时间14-21天。
本方法中，所述步骤2中，的饥饿诱导方法是将树莓松散型愈伤组织切成大小2mm的小块，无菌的培养皿内放置无菌滤纸，培养皿中加入少量的无菌水，水量以全部浸湿滤纸为准；所述步骤2中，的饥饿诱导培养条件是：光照强度为2000lux，光照时间为24h；温度为23℃，饥饿诱导时间为6d。
本方法中，所述步骤3中，胚性愈伤组织接种到ms+20g/l蔗糖培养基中，ph值5.8。；所述步骤3中，胚性愈伤组织培养条件是：光照强度为500-1000lux，光照时间为12h；温度为23-25℃℃，培养时间14-21d。
本发明的优点和积极效果是：
1、采用本方法，采用饥饿处理的方法诱导胚性愈伤组织，与常规的激素方法相比，此方法极为简单，成本低，省时省力，诱导率高，形成的胚性愈伤组织可以分散为多个独立的个体，以这种愈伤组织为诱变对象，可以使得每个突变植株都是由单个独立的胚性变异细胞分裂、分化形成的，从而避免了常规诱变下出现的嵌合体现象；所述的胚性愈伤组织可以通过重新接种到ms培养基中进行胚状体的培养，形成球形胚。
2、本发明中，因为不必经过激素诱导，因此可节约研究时间，另外，采用本方法，针对树莓愈伤组织进行饥饿处理来诱导胚性愈伤组织，饥饿处理时间6d时，诱导率可达到100％；树莓经过饥饿处理后形成的胚性愈伤组织，转移到ms培养基上继续培养14d即可得到球形胚，诱导率可达到95％。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种诱导树莓愈伤组织形成球形胚的方法，步骤如下：
(1)树莓愈伤组织的饥饿处理
剪取树莓无菌苗两叶片间的茎段，接种到1/2ms+0.5+0.5-1.0mg/l2,4-d+100mg/lvc+20g/l蔗糖的培养基上进行松散型愈伤组织的诱导，ph值5.8，培养条件为23-25℃，光照时间12小时，光照强度为500-1000lux。
2-3周后，取培养好的树莓松散型愈伤组织，切成大小2mm的小块进行饥饿处理。取无菌的培养皿，在超净台中将无菌滤纸放在培养皿中，向培养皿中加入少量的无菌水，注意水量以全部浸湿滤纸为准。不要多加或滤纸不能完全浸湿。将树莓愈伤组织团放在准备好的培养皿中。每个培养皿中放入15个愈伤组织团，每个处理设5个重复。将处理好的愈伤组织放在光照条件下培养，具体培养条件为：2000lux光照强度，24h光照；温度为23℃，饥饿处理时间分别为3、6、9、12d。将处理好的愈伤组织放在光照条件下培养，具体培养条件为：2000lux光照强度，24h光照；温度为23℃。
经过不同天数的饥饿处理，树莓愈伤组织出现明显的变化，在体式显微镜下观察变化显著，具体情况见表2。根据体式显微镜和显微镜的观察结果，具体描述如表1所示。
表1饥饿处理对树莓愈伤组织胚性化的影响
从表1可以看出，与对照相比，饥饿处理对树莓愈伤组织的胚性化影响明显。具体来看，处理3d，愈伤组织没有明显变化，在显微镜下只是偶尔见到类似球形胚的结构，以上现象说明，饥饿处理3d对树莓愈伤组织胚性化影响不大，还应加大诱导力度。处理6d的情况要明显好于3d的，从愈伤组织质地来看，表面出现许多球形结构的瘤体，类似球形胚状体结构。在显微镜下可以见到愈伤组织由大量球形结构组成，这些球形结构表面光滑，类似胚状体的球形胚阶段。当处理时间达到9d时，在愈伤组织表面出现一些褐变的愈伤组织，愈伤组织表面出现一些球形结构，且在显微镜下见到部分细胞出现死完的特征，说明处理时间过长，导致愈伤组织内一些细胞衰老死亡。当培养时间达到12d时，愈伤组织基本停止生长，虽然少数愈伤组织质地变硬，但多数细胞褐变死亡，在显微镜下观察到极少的球形结构。
表2不同饥饿时间处理对树莓愈伤组织胚性化细胞所占比例的影响
从表2可以看出，与对照相比，饥饿处理对树莓愈伤组织的胚性化数量影响明显。具体来看，处理3d，出现大约有5％的愈伤组织出现胚性化特征，处理6d，大约有95％的愈伤组织出现胚性化特征，随着天数的增加，出现胚性化的比例也在下降，9d为85％，12d为50％。由此可见，树莓愈伤组织饥饿时间为6d时愈伤组织向着胚性化转变的比例最高。
(2)树莓愈伤组织在ms培养基上的恢复培养
将饥饿处理后形成的胚性愈伤组织从培养皿中转移到ms培养基上进行胚状体的培养，ph值5.8，培养条件为23-25℃，光照时间12小时，光照强度为500-1000lux。14天后观察愈伤组织的变化。
表3愈伤组织在ms培养基上恢复培养后的形态变化及球形胚的数量
从表3可以看出，恢复培养对树莓愈伤组织的胚性化影响明显。具体来看，处理3d后将其转移到无激素的ms培养基上，只在愈伤组织表面有个别球形结构出现，约占5％。而处理6d后恢复培养的可以95％诱导出球形胚结构。
处理9d后恢复培养的不久就会出现褐变，85％愈伤组织死亡。处理12d后恢复培养基的，很快所有愈伤组织就会褐变死亡，说明处理12d是树莓愈伤组织所忍耐饥饿的极限时间。
因此，综上所述，树莓愈伤组织饥饿时间为6d时最有利于愈伤组织向着胚性化转变，球形胚最高诱导率可达95％。