棉花枯萎病防治菌剂的制作方法

本发明涉及植物病害生物防治领域，具体涉及棉花枯萎病防治菌剂。

背景技术：

棉花枯萎病是棉花的重要病害之一，棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)引起的全球性棉花病害。棉花枯萎病是典型的维管束土传病害，在棉花的整个生育期均可发生。利用化学农药具有抑制有益微生物生长、导致药效下降、成本高、危害环境等缺点。

随着人们对绿色农业、有机农业的发展需求，生物防治成为病虫害防治的新措施，同样成为棉花黄萎病防治的新方向。目前，生物防治在预防棉花黄萎病的研究上已经取得了一定成果，但实际使用中遇到很多困难，例如，如何持久抗病性；生防菌剂如何正常定殖并发挥抗病效果；如何顺利将生防菌剂施到靶标位点。

技术实现要素：

本发明从棉花内生细菌为出发点，从棉花茎秆中定向分离，筛选了一株可水解β-1,4糖苷键的内生细菌yupp-10，发现yupp-10对棉花枯萎病病原菌细胞壁几丁质具有水解作用，鉴定并检测了yupp-10对棉花枯萎病的控制作用。其保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2017141。

该菌形态学特征为：革兰氏阳性菌，菌体细胞杆状，末端方，在lb培养基上呈灰白色，不透明，表面较粗糙，似融蜡状，边缘呈锯齿状，微有光泽。但传统的形态学鉴定稳定性较差，会有一定的局限性，分子生物学成为新分类鉴定的重要途径，利用传统的形态学结合分子生物学的手段，对yupp-10进行鉴定，确定为蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)。

yupp-10为棉花内生细菌，存在于棉花组织内部，却没有侵染寄主而造成寄主植物病变。内生细菌能与寄主形成一系列不同关系，如：共生、互惠、共栖和营养寄生等。此外，内生细菌在植物中的定殖类似于病原菌的生态位，适合作为生物防治资源。

生防细菌通过与病原菌竞争生态位、产生抑菌物质抑制病原菌、寄生于病原菌和交叉保护等作用方式直接抑制病原菌的生长和扩散；一些生防菌或其代谢产物能够诱导植物产生系统抗性，从而产生对病原菌的抵抗力。本发明获得的棉花内生细菌yupp-10，对尖孢镰刀菌有直接抑制作用，其培养液对棉苗进行灌根处理，使棉花产生对枯萎病的抗病性。细菌自身繁殖速度快，极易获取，且应用操作简便，在生产上适宜推广应用。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了一种棉花枯萎病防治菌剂，所述菌剂包含蜡状芽孢杆菌yupp-10，其保藏号为cctccno：m2017141。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了一种棉花枯萎病防治菌剂，所述蜡状芽孢杆菌yupp-10的浓度为1×10⁶cfu/ml、1×10⁷cfu/ml或1×10⁸cfu/ml。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了一种尖孢镰刀菌抑菌剂，所述抑菌剂包含蜡状芽孢杆菌yupp-10，其保藏号为cctccno：m2017141。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了一种尖孢镰刀菌抑菌剂，所述蜡状芽孢杆菌yupp-10的浓度为1×10⁶cfu/ml、1×10⁷cfu/ml或1×10⁸cfu/ml。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了保藏号为cctccno：m2017141的蜡状芽孢杆菌yupp-10用于防治棉花枯萎病的应用。

根据本发明的具体实施方式，本发明提供了保藏号为cctccno：m2017141的蜡状芽孢杆菌yupp-10用于抑制尖孢镰刀菌的应用。

本发明的有益效果是：

(1)yupp-10分离自棉花维管束，对人、畜、农作物无毒害作用，对环境无污染破坏。yupp-10为蜡状芽孢杆菌，该菌分布广泛，在水体、空气、土壤、植物组织和动物肠道中均有存在。能够作为水体和土壤改良剂、工程菌和生防制剂等。

(2)yupp-10能够在人工培养基上大量培养，且在适宜条件下，细菌以稳定的几何级数极快增长，以体积比5％的接种量，培养24h便可应用，有利于工厂大规模生产和推广应用。

(3)yupp-10对棉花枯萎病病原菌尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)具有明显的抑制效果，抑制率达到64.68％，对尖孢镰刀菌菌丝有溶解作用。

(4)yupp-10对棉花枯萎病具有防治作用。用yupp-10的lb培养液(细菌浓度为1×10⁷cfu/ml)对棉花进行灌根处理，对棉花枯萎病的防治效果为45.11％。本发明所提供的yupp-10菌剂，对棉花枯萎病有显著的抑制效果，且其生产周期短，制作成本低，使用方便，在植物病害生物防治的应用方面具有十分广阔的前景。

附图说明

图1为yupp-10在lb固体平板上的菌落形态；

图2为yupp-10对尖孢镰刀菌的拮抗作用；

图3为yupp-10对尖孢镰刀菌菌丝的溶解作用；

图4为yupp-10培养液对棉花枯萎病的防治效果。

蜡状芽孢杆菌yupp-10(bacilluscereusyupp-10)，其于2017年4月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)(地址：中国武汉武汉大学邮编430072)，保藏号为cctccno：m2017141。

具体实施方式

实施例1yupp-10菌株分离

(一)菌株的分离

在棉花田块采集表型无病症的棉花植株，将棉花植株表面进行清洗，去皮，剪成2-3cm长的小段。以下步骤在超净工作台中完成，将去皮后的棉花植株用70％乙醇消毒1min，无菌水洗涤3次，3％次氯酸钠消毒处理4min，无菌水洗涤3次，将消毒后的棉花秆剪碎研磨，用无菌水制成悬浮液，涂布于lb平板上，37℃下培养24h，挑取单菌落，根据形态、大小、色泽等特点挑取有差异的单菌落转接到富集培养基平板上，37℃下培养24h，挑选富集培养基上可生长的细菌进一步纯培养。将纯化后的菌株保种。

该菌株为革兰氏阳性菌，菌体细胞杆状，末端方，在lb培养基上呈灰白色，不透明，表面较粗糙，似融蜡状，边缘呈锯齿状，微有光泽。

根据形态特征和分子鉴定结果，将yupp-10归属为蜡状芽孢杆菌bacilluscereus。

实施例2yupp-10对尖孢镰刀菌的抑制作用

(一)试验方法

将yupp-10接入lb液体培养基中，在37℃、170-190rpm/min的恒温摇床中振荡培养24h。在不同pda平板培养基中心接种尖孢镰刀菌，呈三角状对称在pda平板中打孔，每点距离中心20mm，在其中两点接入100μlyupp-10培养液，剩余一点加入100μl的lb液体培养基作为对照，25℃恒温培养观察抑菌情况，4d后测量尖孢镰刀菌菌落半径。

采用以下公式计算yupp-10对病原真菌生长的相对抑制率，每处理重复三次。

菌落半径(cm)＝测量菌落半径-0.25；

相对抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100

(二)培养基

1.lb液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，用去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。

2.lb固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，12g琼脂粉，用去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。

3.pda培养基：200g马铃薯煮沸滤液，20g葡萄糖，12g琼脂粉，加去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。

(三)试验结果

yupp-10对棉花维管束主要病害病原菌尖孢镰刀菌菌丝生长有明显的抑制作用，其相对抑制率在4d时为64.68％，yupp-10对尖孢镰刀菌的拮抗情况见附图2。通过光学显微镜观察到yupp-10处理后对病原菌菌丝有溶解作用，见附图3。

实施例3yupp-10对棉花枯萎病的控制作用

(一)试验方法

1.yupp-10菌剂的制备

将保藏的yupp-10接种在lb固体培养基上，于37℃下培养18h进行活化；将活化的菌株接种在lb液体培养基中，在37℃、180rpm/min振荡培养24h，制成菌种液；按体积比5％的接种量将菌种液接种于lb液体培养基中，在37℃、180rpm/min振荡培养24h得到yupp-10菌剂，稀释为1×10⁶cfu/ml、1×10⁷cfu/ml和1×10⁸cfu/ml备用

2.棉苗的栽培

将pda平板活化的尖孢镰刀菌接种在czapek培养基中，在25℃、160rpm/min的恒温摇床中振荡培养4d，将尖孢镰刀菌接种在灭菌的蛭石玉米培养基中，25℃下培养，直至菌丝长满克氏瓶，取出培养物，在阴凉处风干，备用。

用10％双氧水对棉花种子消毒10min，无菌水清洗3次后，在室温下无菌水浸种处理24h，以感病品种冀棉11为供试品种。棉苗培育使用蛭石沙子无底纸钵定量蘸菌液法，其中将制备好的尖孢镰刀菌蛭石玉米培养物混到蛭石沙土基质中。

播种后7d左右棉苗初现时，用yupp-10菌剂进行灌根处理，每6个营养钵为一个处理，每处理灌200mlyupp-10菌剂；每处理重复4次，以lb液体培养基处理为对照。

棉苗在日光温室中培养，环境温度控制在20-30℃，土壤相对湿度在60％以上，光照良好。在棉苗生长25d左右观察发病情况，调查病情指数，统计防治效果。

棉花枯萎病分级标准：

0级：棉株健康，无病叶，生长正常；

1级：棉株四分之一以下叶片发病，变黄萎蔫；

2级：棉株四分之一以上，二分之一以下叶片发病；

3级：棉株二分之一以上，四分之三以下叶片发病；

4级：棉株四分之三以上叶片发病，或叶片全部脱落，棉株枯死；

病情指数＝[σ(级数×每级的病株数)/(调查的总株数×4)]×100

防治效果(％)＝[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100。

(二)培养基

1.lb液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，用去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。

2.lb固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，12g琼脂粉，用去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0-7.3，于121℃下高温高压灭菌20min。

3.pda培养基：200g马铃薯煮沸滤液，20g葡萄糖，12g琼脂粉，加去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。

4.czapek培养基：2gnano3、0.5gkcl、0.02gfeso4·7h2o、0.5gmgso4、30g蔗糖、1.31gk2hpo4，加去离子水定容到1000ml，调节ph为7.0，于121℃下高温高压灭菌20min。

5.玉米蛭石培养基：将等质量的玉米粉和蛭石加适量水(将培养基捏在手中不滴水)混匀，闷半小时后，放入克氏瓶中，121℃下高温高压灭菌20min。

(三)试验结果

3个不同浓度的yupp-10菌剂对棉花枯萎病的室内防治效果见表1，其中使用浓度为1×10⁷cfu/ml时对棉花枯萎病的防治效果最好，防效达到45.11％，yupp-10对棉花枯萎病的防治效果见附图4。

表1yupp-1对棉花枯萎病的室内盆栽防治效果

注：病情指数和防治效果后面的不同字母，表示不同处理之间差异达显著水平(lsd，p＜0.05)。