本发明属于人精子保存
技术领域：
，具体涉及一种不含卵黄的人精子冷冻保护液及保存方法。
背景技术：
：精液冷冻技术是人类精子库保存精子，得以保持其生命力和受精能力的一项技术。冷冻技术中向精液样本中添加的冷冻保护剂是使精子在降温和低温储存过程中免受冷冻损伤的关键性物质。目前使用的冷冻保护剂中卵黄是主要的成分之一。但是，卵黄来源于鸡蛋，具备有生物源性。卵黄由卵黄颗粒、磷脂和蛋白等生物活性物质组成，难以通过过滤、高温或其它方法达到完全的除菌或灭菌。其中的蛋白质对于人体而言是一种异种蛋白，可能在使用中进入人体引起过敏性反应。再者溶液中混有卵黄颗粒增加了显微镜观察精子时背景存在杂质干扰，且不易去除。技术实现要素：针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种不含卵黄的人精子冷冻保护液及保存方法，可有效解决现有的冷冻保护剂会引起不良反应，无法达到完全灭菌以及增加观察的干扰等问题。为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠90～110mmol/l、氯化钾5～6mmol/l、硫酸镁0.2～0.5mmol/l、氯化钙2～4mmol/l、磷酸二氢钠0.2～0.5mmol/l、碳酸氢钠28～35mmol/l、甘氨酸110～150mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸18～25mmol/l、葡萄糖5～8mmol/l、蔗糖30～60mmol/l、乳酸钠12～15mmol/l、甘油50～100ml/l，余量为超纯水。进一步地，一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠100mmol/l、氯化钾5.365mmol/l、硫酸镁0.49mmol/l、氯化钙2.72mmol/l、磷酸二氢钠0.31mmol/l、碳酸氢钠30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸钠12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量为超纯水。人精子冷冻保存方法，包括以下步骤：(1)将上述精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10～15min，然后按照分段降温方式静置15～20min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。进一步地，步骤(1)中精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3。进一步地，步骤(2)中，在室温下平衡10min。进一步地，步骤(2)中分段降温方式为在-20℃静置5min，接着在-125～-130℃静置10min，使之尽快通过液体的冰晶形成期，进而不会对精子造成伤害。本发明提供的一种不含卵黄的人精子冷冻保护液及保存方法，具有以下有益效果：(1)本发明通过特定的物质组合成精子冷冻保护液，全为可溶性成分，易过滤除菌；不含异种或同种异体蛋白致敏原，也不会引起过敏反应；复苏后镜检，背景清晰，无杂质，不会出现干扰情况；复苏后容易通过稀释或离心去除保护液溶质。(2)本发明产品ph为7.2～7.4，其中，磷酸二氢钠、乳酸钠、碳酸氢钠、甘氨酸和4-羟乙基哌嗪乙磺酸提供强大的酸碱缓冲作用，能够为精子运动提供最适ph范围；此外，甘氨酸的抗氧化作用为精子提供保护作用，葡萄糖和甘氨酸结合，其抗氧化作用加强；葡萄糖、甘氨酸和甘油作为渗透性物质进入到精子细胞内增加细胞内液的晶体渗透压，而分子量大的蔗糖作为非渗透性物质可以增加细胞外液的渗透压同时外吸细胞内水分，可以有效的减少精子冻结时的冰晶形成和损伤；葡萄糖还为精子提供其营养物质；氯化钠、氯化钾、硫酸镁和氯化钙为精子的生存提供必须的无机盐离子。(3)本发明制备的精子冷冻保护液，能明显增加精子的活动能力，并且对精子生理功能无明显的影响，冷冻复苏率高，复苏后的精液在国家法规允许的范围内使用，其临床妊娠率高于20％。具体实施方式实施例1一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠90mmol/l、氯化钾5mmol/l、硫酸镁0.2mmol/l、氯化钙2mmol/l、磷酸二氢钠0.2mmol/l、碳酸氢钠28mmol/l、甘氨酸110mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸18mmol/l、葡萄糖5mmol/l、蔗糖30mmol/l、乳酸钠12mmol/l、甘油50ml/l，余量为超纯水。上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液ph值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。采用上述冷冻保护液保存人精子的方法，包括以下步骤：(1)将精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀，精子冷冻保护液和精液的体积比取决于精液样品中精子浓度，在精液样品达到卫生部精液参数标准前提下，当精液中精子浓度大于等于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1混匀；当精液中精子浓度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:2混匀；当精液中精子浓度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。实施例2一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠110mmol/l、氯化钾6mmol/l、硫酸镁0.5mmol/l、氯化钙4mmol/l、磷酸二氢钠0.5mmol/l、碳酸氢钠35mmol/l、甘氨酸150mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸25mmol/l、葡萄糖8mmol/l、蔗糖60mmol/l、乳酸钠15mmol/l、甘油100ml/l，余量为超纯水。上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液ph值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。采用上述冷冻保护液保存人精子的方法，包括以下步骤：(1)将精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀，精子冷冻保护液和精液的体积比取决于精液样品中精子浓度，在精液样品达到卫生部精液参数标准前提下，当精液中精子浓度大于等于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1混匀；当精液中精子浓度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:2混匀；当精液中精子浓度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。实施例3一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠95mmol/l、氯化钾5.2mmol/l、硫酸镁0.3mmol/l、氯化钙2.5mmol/l、磷酸二氢钠0.3mmol/l、碳酸氢钠30mmol/l、甘氨酸120mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖6mmol/l、蔗糖40mmol/l、乳酸钠13mmol/l、甘油60ml/l，余量为超纯水。上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液ph值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。采用上述冷冻保护液保存人精子的方法，包括以下步骤：(1)将精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀，精子冷冻保护液和精液的体积比取决于精液样品中精子浓度，在精液样品达到卫生部精液参数标准前提下，当精液中精子浓度大于等于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1混匀；当精液中精子浓度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:2混匀；当精液中精子浓度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。实施例4一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠105mmol/l、氯化钾5.5mmol/l、硫酸镁0.4mmol/l、氯化钙3.2mmol/l、磷酸二氢钠0.4mmol/l、碳酸氢钠32mmol/l、甘氨酸140mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸23mmol/l、葡萄糖7mmol/l、蔗糖55mmol/l、乳酸钠14mmol/l、甘油90ml/l，余量为超纯水。上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液ph值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。采用上述冷冻保护液保存人精子的方法，包括以下步骤：(1)将精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀，精子冷冻保护液和精液的体积比取决于精液样品中精子浓度，在精液样品达到卫生部精液参数标准前提下，当精液中精子浓度大于等于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1混匀；当精液中精子浓度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:2混匀；当精液中精子浓度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。实施例5一种不含卵黄的人精子冷冻保护液，包括以下组分且在保存人精子时各组分的终浓度为：氯化钠100mmol/l、氯化钾5.365mmol/l、硫酸镁0.49mmol/l、氯化钙2.72mmol/l、磷酸二氢钠0.31mmol/l、碳酸氢钠30.95mmol/l、甘氨酸133.2mmol/l、4-羟乙基哌嗪乙磺酸20mmol/l、葡萄糖5.51mmol/l、蔗糖50mmol/l、乳酸钠12.86mmol/l、甘油70ml/l，余量为超纯水。上述不含卵黄的人精子冷冻保护液的制备过程：用分析天平准确称取各组分即氯化钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、甘氨酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、蔗糖、乳酸钠和甘油，然后将各组分溶于超纯水中，制成各组分的母液，其母液浓度的配制主要是根据所要保存的人精子浓度情况而定，然后将各组分混合，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，同时要保证溶液ph值为7.4，最后采用孔径为0.22μm的过滤器过滤除菌，无菌保存。采用上述冷冻保护液保存人精子的方法，包括以下步骤：(1)将精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1～3混匀，精子冷冻保护液和精液的体积比取决于精液样品中精子浓度，在精液样品达到卫生部精液参数标准前提下，当精液中精子浓度大于等于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:1混匀；当精液中精子浓度大于等于100×106/ml而小于150×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:2混匀；当精液中精子浓度大于等于60×106/ml而小于100×106/ml时，精子冷冻保护液和精液按体积比为1:3混匀；(2)将步骤(1)所得混合物在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min；(3)将步骤(2)所得物转移到-196℃液氮中保存。实验例1生物毒性实验选用健康男性精液作为样品，用本品(试验组)及市售含卵黄的精子冷冻保护液(对照组)在相同条件下稀释(此处的稀释为精液和冷冻保护液混合)，稀释后0min、60min、120min、180min以及240min，分别观察比较其前向运动精子百分比(平均值)，结果见表1：表1不同时间点前向运动精子百分比(％)0小时1小时2小时3小时4小时对照组63.862.353.849.345.1试验组64.763.558.756.550.7实验例2复苏实验检测方法：选取健康男性精液作为样品，按照精子冷冻保护液(本发明实施例5制备的产品)和精液的比例关系将精子冷冻保护液和精液充分混匀，以市售的含卵黄的冷冻保护液作为对比例。混匀后在室温下平衡10min，然后在-20℃静置5min，接着在-125℃静置10min，再直接投于-196℃液氮中，当混合液温度稳定后，从液氮中取出冷冻精液，在37℃水浴摇床中解冻。解冻后，显微镜下观察比较前向运动精子百分比，计算其冷冻复苏率。冷冻复苏率＝冻后前向运动的精子数量/冻前前向运动的精子数量×100％。实验例和对比例分别设置10个平行，平均冷冻复苏率分别为71.24％和62.1％。本发明所采用的精子冷冻保护液不含卵黄，不存在致病菌感染的风险，且配方合理科学，所得到的冷冻效果与现有含卵黄的冷冻保护液相比，其精子冷冻复苏率高。通过观察其精子形态、顶体完整性等，其形态完整率和顶体完整率明显比现有的冷冻保护液保护的精子完整率高，说明本发明精子冷冻保护液对精子不会产生破坏。采用本发明精子冷冻保护液冷冻保存的精子在国家法规允许的范围内使用后，临床妊娠率高于20％，说明本发明精子冷冻保护液不会对精子生理功能产生明显影响。当前第1页12