本发明属于畜禽冷冻精液制作技术领域，具体涉及一种山羊细管冻精制作方法。
背景技术：
山羊精液冷冻保存是人工授精技术的一个重大突破，不仅从时间和空间拓展了种公羊精液利用效率，充分发挥优良种公羊的繁殖性能，而且对于优良种畜禽或特色种畜禽的保种和引种、降低生产成本等方面亦有重要的意义。我国对山羊精液冷冻保存技术的研究始于20世纪80年代，经过多年实验研究和生产实践探索，山羊颗粒冻精和细管冻精制作都已获得了关键性的技术突破，而且一些地区已经建立了羊冷冻精液生产操作规程。由于山羊颗粒冷冻精液没有包装，长期保存表皮很容易脱落，解冻过程都容易污染，因此在生产实践中逐渐被细管冷冻精液所取代。山羊细管冷冻精液无论是制作还是解冻输精过程都能很好的规避污染，冻后精液品质和使用效果也都优于颗粒冻精。如cn103518706a、cn104705290a分别公开了绵羊和奶山羊的细管冻精制作方法。但细管冷冻精液制作是仍然一个复杂的过程，不仅需要适宜的稀释剂、保护剂、平衡温度和平衡时间、降温速率及解冻速率，而且还需要程序降温仪、灌装封口等设备。如能研发一种操作简便快捷山羊细管冻精制作方法，将极大限度的促进山羊冷冻精液的应用和推广。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种山羊细管冻精制作方法，所述的细管冻精制作方法操作简便快捷、无需复杂仪器设备。
本发明的目的通过下述的技术方案实现：一种山羊细管冻精制作方法，该方法具体操作步骤如下：
(1)冷冻稀释液的准备：无菌条件下，将冷冻精液稀释液预温于34-36℃水浴中；
(2)采精和镜检：采用电刺激法或假阴道法采集山羊精液，对精液品质进行常规：鲜精活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于108个/ml；
(3)稀释：按照山羊射精量与冷冻稀释液1:1的比例将步骤(1)预温的冷冻稀释液缓慢倒入步骤(2)检测合格的鲜精中，进行第一次稀释，并摇晃均匀，避光放于室温环境静置30-60min，再用步骤(1)预温的冷冻稀释液进行第二次稀释，稀释方法同前，即预温的冷冻稀释液缓慢倒入精液中，并摇晃均匀，稀释比例通常1:(5至8)，精液稀释最终密度不低于106个/ml；
(4)分装：将步骤(3)稀释后的精液分多段吸入细管进行精液分装，即先吸入部分稀释精液后吸取部分空气再吸取部分稀释精液；
(5)平衡：经步骤(4)分装好的细管精液，平放用6-8层的无菌纱布包裹，置于2-5℃冰箱中避光平衡2-2.5h；
(6)冷冻：在泡沫箱中加注液氮，并将步骤(5)平衡后的细管精液平铺于冷冻架上，液氮面与细管精液保持2.5-3cm的距离，熏蒸冷冻至少8min，冷冻结束后将细管精液快速移入液氮中；
(7)解冻和复检：将步骤(6)的细管冻精从液氮中捞出，快速投入36-37℃的恒温水浴中解冻15-20s，将细管中精液充分混匀后对精液品质进行常规检查，解冻后活力不低于35％、活率不低于50％、密度不低于106个/ml可用于人工授精或长期冷冻保存。
进一步的，所述步骤(3)对镜检合格的鲜精采用2次稀释法进行稀释，第一次稀释是按照射精量与稀释液等体积1:1稀释，第二次稀释是根据精子密度进行定量稀释，且两次稀释方法是都将稀释液缓慢倒入精液并混合均匀。
进一步的，分装完成后用封口粉标记。
进一步的，所述步骤(6)细管精液位于液氮面上方2.5-3cm处进行熏蒸冷冻，冷冻时间8min-10min，通过超低温温度计测定熏蒸1min时细管精液温度降至-60℃以下，熏蒸2min时细管精液温度可降至-80℃以下，熏蒸4min时细管精液温度可降至-96℃以下，熏蒸8min时细管精液温度-130℃以下。
采用上述技术方案后，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的山羊细管冻精制作方法操作简便快捷、无需复杂仪器设备，在鲜精品质满足要求的情况下，经冷冻解冻的细管冻精活率不低于0.35，不仅能满足人工授精对冻精的活率要求，还能充分提高公羊的利用率，突破动物寿命的限制，实现公羊精液的长期保存，极大限度的促进山羊冷冻精液的应用和推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明实施方式不局限于此。
实施例1
一种山羊细管冻精制作方法，包括有冷冻稀释液的准备、采精和镜检、精液稀释、精液分装和平衡、精液冷冻、解冻和复检。具体操作步骤如下：
(1)冷冻稀释液的准备：无菌条件下，将购买的卡苏ovixcell羊用精液稀释液(货号：020997)无菌条件分装至50ml离心管并预温于34℃水浴中；
(2)采精和镜检：采用电刺激法采集5只海南黑山羊种公羊精液，对精液品质进行常规检查，选择活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于108个/ml鲜精用于后续冻精制作；
(3)稀释：按照山羊射精量与冷冻稀释液1:1的比例将步骤(1)预温的冷冻稀释液缓慢倒入步骤(2)检测合格的鲜精中，进行第一次稀释，并摇晃均匀，避光放于室温环境(17℃)静置1h，再用步骤(1)预温的冷冻稀释液进行第二次稀释，精液稀释最终密度不低于106个/ml；
(4)分装：将步骤(3)稀释后的精液分多段吸入细管进行精液分装，即先吸入部分稀释精液后吸取部分空气再吸取部分稀释精液，空气间隔有利于缓冲冷冻后体积膨胀压力和快速解冻后的混合均匀，分装完成后末端蘸取少量封口粉封口并作标记；
(5)平衡：经步骤(4)分装好的细管精液，平放(勿堆叠)用6-8层的无菌纱布包裹，置于4℃冰箱中避光平衡2.5h；
(6)冷冻：在泡沫箱中加注液氮，并将步骤(5)平衡后的细管精液平铺于冷冻架上，液氮面与细管精液保持2.5-3cm的距离，熏蒸冷冻8min，冷冻结束后将细管精液快速移入液氮中；
(7)解冻和复检：将步骤(6)的细管冻精从液氮中捞出，快速投入37℃的恒温水浴中解冻15s，将细管中精液充分混匀后对精液品质进行常规检查。
实施例2
一种山羊细管冻精制作方法，包括有冷冻稀释液的准备、采精和镜检、精液稀释、精液分装和平衡、精液冷冻、解冻和复检。具体操作步骤如下：
(1)冷冻稀释液的准备：无菌条件下，按照下述方法配制冷冻稀释液，准确称取tris3.07g、果糖1.26g、柠檬酸1.64g、青霉素100000iu、链霉素0.1g、甘油5ml、磷脂酰胆碱1.6g和胆固醇0.4g加入85ml双蒸水中，调节ph6.8-7.0，加入双蒸水定容至100ml，经0.22μm孔径的无菌滤器过滤，无菌条件分装至50ml离心管并预温于34℃水浴中；
(2)采精和镜检：采用电刺激法采集5只海南黑山羊种公羊精液，对精液品质进行常规检查，选择活力不低于65％、活率不低于60％、密度不低于108个/ml鲜精用于后续冻精制作；
(3)稀释：按照山羊射精量与冷冻稀释液1:1的比例将步骤(1)预温的冷冻稀释液缓慢倒入步骤(2)检测合格的鲜精中，进行第一次稀释，并摇晃均匀，避光放于室温环境(17℃)静置1h，再用步骤(1)预温的冷冻稀释液进行第二次稀释，精液稀释最终密度不低于106个/ml；
(4)分装：将步骤(3)稀释后的精液分多段吸入细管进行精液分装，即先吸入部分稀释精液后吸取部分空气再吸取部分稀释精液，空气间隔有利于缓冲冷冻后体积膨胀压力和快速解冻后的混合均匀，分装完成后末端蘸取少量封口粉封口并作标记；
(5)平衡：经步骤(4)分装好的细管精液，平放(勿堆叠)用6-8层的无菌纱布包裹，置于4℃冰箱中避光平衡2.5h；
(6)冷冻：在泡沫箱中加注液氮，并将步骤(5)平衡后的细管精液平铺于冷冻架上，液氮面与细管精液保持2.5-3cm的距离，熏蒸冷冻8min，冷冻结束后将细管精液快速移入液氮中；
(7)解冻和复检：将步骤(6)的细管冻精从液氮中捞出，快速投入37℃的恒温水浴中解冻15s，将细管中精液充分混匀后对精液品质进行常规检查。
检测步骤如下：
(1)活力的测定：
分别取稀释后的鲜精、平衡后精液和解冻后的细管冻精5ul滴于37℃预热的载玻片上，盖上盖玻片，10×20倍显微镜下进行检测；每份精子活力在5个不同视野中进行评估，5个连续评估值的平均值作为最后的精子活力值，计算公式如下：
精子活力＝(直线前向运动精子数/精子总数)×100％。
(2)顶体完整率的测定：
取解冻后的精液50μl制作精子涂片，自然风干，水平摆放于染色架上，用4％的多聚甲醛固定15min→蒸馏水洗5次×3min/次→晾干→滴加吉姆萨染色液2ml/片染色90min后→水洗蒸馏水洗5次×5min/次→晾干→10×100倍显微镜镜检，精子顶体呈紫色，且包围精子头前部的为顶体完整的精子，计算公式如下：
顶体完整率＝(体完整的精子数/精子总数)×100％；
实施例1和2冻前冻后精子活力和顶体完整率检测结果见表1。
表1本发明所述细管冻精制作效果分析
由表1可知，无论是采用购置的羊用商品冷冻稀释液或自行配制冷冻稀释液，通过本发明所述的细管冻精制作方法，解冻后精子活力均达到35％以上，可用于人工授精。
实施例涉及的主要试剂和耗材：法国卡苏公司ovixcell羊用精液稀释液(货号：020997)，法国卡苏公司0.25ml细管，超低温温度计，生物显微镜，恒温水浴锅，泡沫箱，液氮等。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。