本发明属于农业技术领域，涉及一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法。
背景技术：
暗紫贝母(fritillariaunibracteatahsiaoetk.c.hsia)为百合科贝母属植物，是我国特有的名贵中药材，也是贝母中经济价值最高的类群，它以地下干燥鳞茎入药，具有止咳化痰、清热润肺及散结等多重药效(中国植物志编辑委员会，1980；徐国钧，1997；韵海霞，2010)。尤其适合于老年人和儿童久治不愈的顽固性虚寒咳嗽。该物种主要分布于四川西北部(松潘、若尔盖、马尔康、刷经寺、洪源、理县)、青海南部以及甘肃南部等地，生长于海拔2800～4500m的高山草地以及高山草甸和灌丛草地中，分布范围十分有限，并且生长过程中对土壤、气候、温度等生长环境条件要求苛刻(马吉义，2011)。由于暗紫贝母在中药材市场上的需求量逐年攀升，导致人们过度采挖，野生资源极度匮乏，商品供不应求，暗紫贝母价格不断上涨，但是限于生长环境特殊，鳞茎生长周期长，从种子播种到长成商品药材一般需要四年时间(gaosl，1999；马吉义，2011)，且种子萌发率低，大大限制了暗紫贝母的人工规模化栽培。因此如何保护这一濒危种质资源，扩大其种植规模以满足市场需求，就成为一个急待解决的问题。
近年来关于暗紫贝母的研究报道日趋增多，其中，较多的研究主要在化学成分的测定和比较(kanekok，1986；余世春，1990和1992；颜晓燕，2012)；药理作用上多针对川贝母，对暗紫贝母的的研究相对较少(高山林，2000)。在生态学方面，研究的内容涉及到暗紫贝母的生态分布及植被性质(陈士林，1993和1997；徐波，2013)，以及暗紫贝母个体生长和物候与融雪梯度和海拔梯度之间的关系(陈文年，2012和2013)。人工种子繁殖上，由于种子采集困难，休眠期长，且存在形态后熟和生理后熟，播种后出苗率低，难以形成规模化种植(于婧，2008)。组织培养是利用生物技术快速繁育植物种苗的主要手段之一，对于利用组培技术繁殖暗紫贝母的研究上虽有一定的报道(蔡朝辉等，1992；李隆云等，1995；高山林等，2000)，但多限于试验性的探讨以及组培鳞茎和野生鳞茎的化学成分比较分析，快速繁育种苗的技术体系尚未成熟，离幼苗规模化生产还有一定的距离；对组培苗的炼苗驯化栽培方面亦未见报道。
暗紫贝母的增殖增殖率不高、在增殖过程中易出现玻璃化和褐化现现，生根难和粗短肉质根出现频率较高等系列问题，影响整个快速繁殖体系。总体而言，目前暗紫贝母的人工繁育及栽培实际上还处于实验阶段，尚未形成真正意义上的规模化种植。这其中，不能大量地生产人工种苗正是限制其规模化种植的瓶颈。鉴于人们对暗紫贝母药用价值的扩大认识后，必将进一步加速市场的需求量，野生资源现已极度匮乏，这就为暗紫贝母人工规模化栽培提供契机。因此，通过生物技术手段解决暗紫贝母栽培过程中的种苗问题将是发展暗紫贝母规模化种植的必然趋势。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法，采用l16(45)正交试验法和系统试验法筛选适宜暗紫贝母种苗快速繁育的培养基配方，解决了暗紫贝母小鳞片无菌繁殖过程中增殖率不高、易褐化、生根难等技术问题。
其具体技术方案为：
一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法，包括以下步骤：
步骤1、无菌小鳞片的获得：从野外采集暗紫贝母2-3年生鳞茎，带回实验室进行消毒处理，处理过程为先在自来水中用湿棉布清洗干净鳞茎外表面泥沙；然后从鳞茎基部分离鳞片，自来水冲洗2-12h；再转至超净工作台，依次用70％酒精处理30-40s，无菌水冲洗2-3次，0.1％hgcl处理6-10min，无菌水冲洗3-5次；最后转接入ms基本培养基进行模拟原生境环境温条件暗培养，昼夜温度为18-20℃/8-12℃，期间注意观察污染情况，及时转接未污染材料至新的ms培养基中，培养20-30d后即可获得一定数量的无菌小鳞片。
步骤2、无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽的诱导：在前期测定暗紫贝母原生境地土壤营养元素的基础上，设计l16(45)正交试验，考虑母液类型、tdz浓度、kt浓度、iaa浓度和naa浓度5个因素，优化无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽诱导的配方。其中愈伤组织诱导的适宜配方为ms+0.5-1.0mg/ltdz+0.5-1.0mg/lkt+0.1-0.2mg/liaa+0.1-0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；增殖配方为自配1+0.5-1.0mg/ltdz+0.05-0.1mg/lkt+0.05-0.1mg/liaa+0.01-0.05mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，其中自配1根据暗紫贝母原生境地土壤营养元素含量而设计，其详细组分为5.794mg/lnh4no3+42.372mg/l(nh4)2hpo4+110.91mg/lcacl2.2h2o+13.913mg/lmgso4+16.895mg/lkh2po4+24.186mg/lna2hpo4培养条件与步骤1相同，愈伤组织诱导培养45d后，诱导率可达63％左右，小鳞片直接增殖培养75d，增殖率可达775％左右。
步骤3、丛生小鳞茎的增殖培养：基于前期研究发现，暗紫贝母丛生小鳞茎在增殖过程中易出现水浸状玻璃化和褐化现象，本研究在转入增殖培养基后，采取了10-12℃低温连续培养30-45d后，再进行正常变温暗培养，可有效防止再生鳞茎在继代增殖过程中的玻璃化和褐化现象。培养基采用自配1+1.0-2.0mg/l6-ba+0.1-0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，昼夜温度为18-20℃/8-12℃，培养90d后，增殖率可达532％左右。
步骤4、再生小鳞茎的生根诱导：待再生小鳞茎长至一定大小后，将其分离成单个小鳞茎，转入生根培养基中，进行生根培养。暗紫贝母生根困难、粗壮肉质根出现频率较高，因此在进行生根培养时要筛选健壮的再生小鳞茎为生根材料，生根前需提前在4-12℃低温下培养10-20d，以抑制小鳞茎玻璃化和增加生根率，平均每一枚再生小鳞茎的生根率可达4-7条，培养基配方为自配1+naa0.1-0.5mg/l，培养条件同步骤1，待根长0.5-1cm时即可开始移栽驯化。
步骤5、生根小鳞茎的移栽驯化：生根小鳞茎的出瓶时间最好选择每年的4-5月，将无菌生根小鳞茎连同培养瓶一起运往原生境地进行驯化栽培，移栽前将生根小鳞茎小心从培养瓶取出，洗净根表面培养基，再放入80％甲基托布津1000倍液中浸泡1-5min后，移栽到原生境土中，期间注意人工调控炼苗温度为12-20℃，湿度80％左右；遮阴80％以上，驯化时间为1个月，待小鳞茎芽出土后，可逐渐去除遮阳网。
进一步，步骤2中，所述愈伤组织诱导的培养基配方为ms+1.0mg/ltdz+1.0mg/lkt+0.2mg/liaa+0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；鳞茎增殖的培养基配方自配2+2.0mg/ltdz+0.1mg/lkt+0.05mg/liaa+0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；步骤3中，所述培养基配方为自配1+2.0mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；步骤4中，所述培养基配方为自配1+naa0.2mg/l。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，暗紫贝母增殖率较前人研究有所提高；解决了暗紫贝母再生小鳞茎增殖过程中易褐化、生根难、畸形根多等问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法，包括以下步骤：
步骤1、无菌小鳞片的获得：从野外采集暗紫贝母2-3年生鳞茎，带回实验室进行消毒处理，处理过程为先在自来水中用湿棉布清洗干净鳞茎外表面泥沙；然后从鳞茎基部分离鳞片，自来水冲洗2-12h；再转至超净工作台，依次用70％酒精处理30-40s，无菌水冲洗2-3次，0.1％hgcl处理6-10min，无菌水冲洗3-5次；最后转接入ms基本培养基进行模拟原生境环境温条件暗培养，昼夜温度为18-20℃/8-12℃，期间注意观察污染情况，及时转接未污染材料至新的ms培养基中，培养20-30d后即可获得一定数量的无菌小鳞片。
步骤2、无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽的诱导：在前期测定暗紫贝母原生境地土壤营养元素的基础上，设计l16(45)正交试验，考虑母液类型、tdz浓度、kt浓度、iaa浓度和naa浓度5个因素，优化无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽诱导的配方。其中愈伤组织诱导的适宜配方为ms+0.5-1.0mg/ltdz+0.5-1.0mg/lkt+0.1-0.2mg/liaa+0.1-0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l；增殖配方为自配1+0.5-1.0mg/ltdz+0.05-0.1mg/lkt+0.05-0.1mg/liaa+0.01-0.05mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，其中自配1根据暗紫贝母原生境地土壤营养元素含量而设计。培养条件与步骤1相同。
步骤3、丛生小鳞茎的增殖培养：基于前期研究发现，暗紫贝母丛生小鳞茎在增殖过程中易出现玻璃化和褐化现象，本研究在转入增殖培养基后，采取了10-12℃低温连续培养30-45d后，再进行正常变温暗培养，可有效防止再生鳞茎在继代增殖过程中的玻璃化和褐化现象。培养基采用自配1+1.0-2.0mg/l6-ba+0.1-0.2mg/lnaa+琼脂粉5.8g/l+蔗糖30g/l，昼夜温度为18-20℃/8-12℃。
步骤4、再生小鳞茎的生根诱导：待再生小鳞茎长至一定大小后，将其分离成单个小鳞茎，转入生根培养基中，进行生根培养。暗紫贝母生根困难、粗壮肉质根出现频率较高，因此在进行生根培养时要筛选健壮的再生小鳞茎为生根材料，生根前需提前在4-12℃低温下培养10-20d，以抑制小鳞茎玻璃化和增加生根率，培养基配方为自配1+naa0.1-0.5mg/l，培养条件同步骤1，待根长0.5-1cm时即可开始移栽驯化。
步骤5、生根小鳞茎的移栽驯化：生根小鳞茎的出瓶时间最好选择每年的4-5月，将无菌生根小鳞茎连同培养瓶一起运往原生境地进行驯化栽培，移栽前将生根小鳞茎小心从培养瓶取出，洗净根表面培养基，再放入80％甲基托布津1000倍液中浸泡1-5min后，移栽到原生境土中，期间注意人工调控炼苗温度为12-20℃，湿度80％左右；遮阴80％以上，待小鳞茎芽出土后，可逐渐去除遮阳网。
步骤4中，所述培养基配方为自配1+naa0.2mg/l。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。