本发明属于蔬菜种植技术领域，具体涉及一种利用ga3显著降低叶用莴苣镉含量的方法。
背景技术：
据我国地质调查局发布的《中国耕地地球化学调查报告(2015)》显示，我国有232万hm2重金属中重度污染或超标耕地，占总耕地的16.1％。2014年4月17日环境保护部和国土资源部联合公布了全国土壤污染调查公报，指出我国土壤环境状况令人堪忧，cd等重金属污染问题相对比较突出，从污染分布情况看，南方土壤污染较重，北方土壤污染相对较轻，西南、中南地区土壤重金属超标范围较大。
cd含量分布呈现出从东北到西南、从西北到东南方向逐渐升高的态势，cd点位超标率为7.0％，在污染土壤中占比最大，其中，轻微污染、轻度污染、中度污染、重度污染的比例分别为5.2％，0.8％，0.5％，0.5％。污染土壤的cd含量为2.5～23.0mg/kg，重污染区表层土壤的cd含量高出底层土壤几十倍甚至更高。
根据农业部环境监测系统检测数据显示，与国家标准相比，蔬菜中cd含量超标率高达23.5％。通过对成都地区的9种蔬菜152个样品的可食部分中重金属元素分析，发现cd是成都地区蔬菜中的主要污染元素之一，在检测样品中，cd的超标率为29.4％,最高超标5.6倍。
由此可见，目前我国cd污染现状不容乐观，己威胁到食品安全和人体健康，须引起高度重视。
不同植物对不同重金属的吸收有一定规律，一般而言，蔬菜可食部分吸收重金属的比率大于粮食作物，同种蔬菜对重金属cd的富集大于其他重金属元素。但蔬菜对cd的吸收因蔬菜种类、品种以及器官不同而不同。
植物对矿质营养的吸收具有基因型差异，同样蔬菜对cd的吸收、累积也具有基因型差异，这种差异是引起不同蔬菜cd含量差异的重要原因之一。
李博文等研究发现：茄子、丝瓜、番茄、辣椒等为cd低积累型蔬菜；白萝卜、菜花、莴苣、大葱等为中度积累型；芹菜、茴香、香菜、蓬蒿为重度积累型；白菜、油菜属极重度积累型。马往校等研究几种蔬菜中cd的污染状况，结果表明，不同的蔬菜中cd的积累规律为芹菜＞韭菜＞莴笋＞小白菜＞花菜＞西葫芦、黄瓜、青椒，芹菜和莴笋对cd具有较强的吸收能力，超标最严重。
同种蔬菜的不同品种对重金属的吸收也存在较大差异。以胡萝卜为例，nairobi对cd的吸收量为1.215mg/kg，而amsterdam的吸收量则为2.521mg/kg，其它5种蔬菜的不同品种对镉离子也存在差异性吸收。王松良等研究发现13种不同基因型的小白菜茎叶中cd含量差别很大。相同cd浓度下，不同小白菜品种间cd含量相差最高达4.3倍，且外界cd浓度越高，品种间差异越大。
目前，对于重金属胁迫下的植物生长的研究，主要是通过研究植物内调节其生长的物质来进行。目前已知的植物生长调节因子是人们在提高植物抗逆性时考虑的主要因素。不过，现有已知植物生长调节因子在调节植物抗逆性时，专一性较差，难以形成对于多种胁迫情况统一的处理办法，甚至不同胁迫情况的处理办法还会大相径庭。对于重金属胁迫而言，由于该胁迫区别于高温、高盐等一般胁迫，在处理重金属胁迫时，不仅要提高蔬菜的抗氧化活性和植物生长性能，更为重要的是需要降低重金属在蔬菜中的积累，才能达到蔬菜种植的目的。
目前，对于解决生菜的重金属胁迫(特别是镉胁迫)的研究还相对较少，原因在于目前对于重金属对于生菜的影响的机理尚未研究透彻，相应的处理办法仍在摸索当中。
《外源一氧化氮对镉胁迫下花生与生菜生长的缓解效应及其机理研究》通过对生菜施用外源一氧化碳显著降低了生产在镉胁迫下的镉含量。
《水杨酸对镉胁迫下莴苣幼苗生长和氧化胁迫的缓解效应》研究了对于茎用莴苣施用水杨酸对于镉胁迫的缓解效应。不过该报道在对于镉积累方面的探究中，提到水杨酸对于cd从根系向上部的运输具有促进作用。在其研究基础上，施用外源水杨酸有可能对降低镉含量是无益的。
因此，如何降低在镉胁迫下生菜中的镉含量，对于生菜种植技术领域而言，是亟待研究的技术问题。
技术实现要素：
针对现有技术面临的技术难题，本发明的目的在于提供一种利用ga3显著降低叶用莴苣镉含量的方法，其包括如下步骤：当叶用莴苣幼苗成熟后，用浓度为1～10μmol/l的ga3水溶液进行叶面喷施，喷施量以叶面滴水为度，每隔2天喷施1次，共喷施3次。
优选的，所述ga3水溶液的浓度为2.5～5μmol/l。
更优选的，所述ga3水溶液的浓度为2.5μmol/l。
优选的，在利用ga3水溶液进行叶面喷施时，喷施时间为清晨。
优选的，第1次喷施ga3水溶液的时间为叶用莴苣幼苗成熟后的第3天。
所用叶用莴苣为玻璃生菜。
本发明的有益效果：
1、本发明促进了cd胁迫下生菜的生长，显著提升了株高；
2、本发明缓解了cd胁迫对生菜光合速率的抑制；
3、本发明缓解了cd诱导的氧化胁迫对细胞膜的伤害，降低了生菜mda含量和电解质渗透率；
4、本发明降低了生菜地上部cd含量和硝酸盐含量，提高了生菜的品质。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
选择大小一致，籽粒饱满的生菜种子(购买自广东科农蔬菜种业有限公司，品种为四川地区常见的玻璃生菜)，在10％(m/m)过氧化氢溶液中消毒10min，随后用超纯水洗净，均匀放置于垫有滤纸的培养皿中，保持充足水分，于20℃人工培养箱中进行催芽。种子露白0.5cm后，播于装有干净河沙的搪瓷托盘里进行沙基培养。根据生长状况，每天适时适量向沙基中喷淋1/2hoagland营养液，培养箱设置为23℃/18℃(昼/夜)，光照14h。待幼苗4片真叶完全展开时，选择长势一致的壮苗移栽至装有干净河沙(起固定作用)的10cm×10cm(底×高)塑料花盆中(花盆底部垫有纱布，防止河沙漏出)，每盆2株，并将花盆置于高8cm的塑料盘中，盘中装满含有cd的hoagland全营养液，cd浓度为10mg/l(以cdcl2·2.5h2o2加入)，每2d更换一次营养液。待移栽的生菜幼苗完全成活(2d)后，用不同浓度的ga3溶液于9:00喷布生菜叶片，以叶片滴水为度，每隔2d一次，共喷3次。以不添加cd全营养液栽培，喷施清水的生菜为对照(ck)，含10mg/lcd全营养液栽培，喷施清水的生菜为对照1(ck1)。设置4个浓度梯度(1μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l)，每个处理重复3次。
在喷施ga330d后，生菜成熟期采样。整株测定生长及形态指标后，按地上部(可食部)、根部分别保存鲜样和干样。鲜样用液氮采样后，于超低温冰箱中-80℃保存以备生理指标和品质指标的测定；干样用烘箱105℃杀青15min后以75℃烘干至恒重，粉碎后用于cd含量的测定。
生长指标及生物量：
株高、根长采用毫米刻度尺测量，茎粗用游标卡尺测量。
生物量：用自来水将植物样品整株洗净后，再用去离子水反复冲洗，拭干。将生菜分为地上部和根部，用电子天平称取鲜重。随后将地上部与根系分装，用烘箱105℃杀青15min，75℃烘干至恒重，称取干重。
光合色素及光合参数：
光合色素含量采用丙酮乙醇混合液浸提法[84]测定。
选取生菜的第2-3片功能叶，用li-6400xt(li-cor，美国)便携式光合仪测定pn、gs、tr、ci和ls，测定时设定内源光强为1000μmol·m-2·s-1，co2浓度为400μl·l-1，温度为25℃。
细胞膜透性、渗透调节物质及根系活力：
mda含量采用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸含量采用磺基水杨酸法；根系活力采用氯化三苯基四氮唑(ttc)法测定。
细胞膜透性采用电导法测定：称取0.2g生菜样品放入20ml去离子水中，常温振荡30min，测定溶液电导率(a)；然后将生菜样品与去离子水一起于100℃下煮沸20min，使用去离子水调整至加热前体积，测定溶液电导率(b)。细胞膜透性(％)＝电导率(a)/电导率(b)×100％
抗氧化酶活性：
sod活性采用氮蓝四唑(nbt)法；pod活性采用愈创木酚法；cat活性采用紫外吸收法。
品质指标：
可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝g-250染色法；可溶性糖含量采
用蒽酮比色法；
硝态氮含量采用水杨酸比色法。
cd含量：
将生菜干样用hno3-hclo4消化，用icp-8000电感耦合等离子体发射光谱仪(perkinelmer，美国)测定。
数据处理：
所有数据采用excel2010软件进行整理；spss20.0进行方差分析及相关性分析，duncan新复极差法进行多重比较。根冠比＝根系干重/地上部干重，ls＝1－ci/ca，转运系数＝地上部cd含量/根系cd含量。
外源ga3对cd胁迫下生菜生长的影响
从表1中可以看出，cd污染土壤中，生菜叶面喷施ga3，促进了生菜的伸长生长和增粗生长。喷施ga3显著提升了cd胁迫下生菜的株高。ga3浓度为2.5～10μmol/l的处理之间，生菜株高差异不显著，均显著高于其他处理。cd胁迫下，随ga3浓度的升高，生菜茎粗先增加后降低，在ga3浓度为2.5μmol/l时最高，比ck1高14.79％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为1μmol/l和10μmol/l时，生菜茎粗的值虽比ck1高，但与ck1无显著差异。cd胁迫下，喷施ga3后各处理生菜根长均与ck1无显著差异，当ga3浓度为2.5μmol/l时最长，为10.06cm。
表1ga3对cd胁迫下生菜生长的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜生物量的影响
随着ga3浓度的升高，cd污染下生菜地上部鲜重、干重和根系干重先增加后减少。1μmol/l和2.5μmol/lga3处理的生菜地上部鲜重虽分别比ck1高2.26％和3.56％，但与ck1无显著差异。喷施ga3浓度为5μmol/l和10μmol/l时，生菜地上部鲜重与ck1相比分别降低了5.83％(p＞0.05)和8.75％(p＜0.05)。cd胁迫下，喷施ga3生菜地上部干重与地上部鲜重变化趋势一致，在ga3浓度为2.5μmol/l时，生菜地上部干重最高，比ck1高4.62％。喷施高浓度(≥5μmol/l)的ga3后，加剧了cd污染下生菜地上部干重降低，当ga3浓度为10μmol/l时最低，比ck1低6.94％(p＜0.05)。cd胁迫下，根系干重最大值出现在喷施ga3浓度为2.5μmol/l的处理，最小值出现在ga3浓度为10μmol/l时。喷施1～5μmol/l的ga3后，生菜根冠比大于ck1，当喷施10μmol/l的ga3后，生菜根冠比降低，比ck1低4.51％。
表2ga3对cd胁迫下生菜生物量的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜光合色素含量的影响
ck1叶绿素a，叶绿素b和叶绿素总含量分别比ck低16.71％(p＜0.05)，17.57％(p＜0.05)和16.90％(p＜0.05)。cd胁迫下，生菜叶片类胡萝卜素含量较ck稍低，但无显著差异。喷施ga3的各处理叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总含量和类胡萝卜素含量均与ck1无显著差异。当ga3浓度为2.5μmol/l时，cd胁迫下生菜叶片叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素含量最高，分别比ck1高9.80％，11.48％和3.19％，均与ck差异不显著。喷施ga3浓度为10μmol/l时，生菜叶片叶绿素a，叶绿素b和类胡萝卜素含量最低，分别比ck1低4.29％，4.37％和7.45％，均与ck差异显著。
表3ga3对cd胁迫下生菜光合色素含量的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜光合作用的影响
由表4可知，ck1与ck相比，生菜pn和ls显著降低，而gs、ci和tr显著升高。cd胁迫下，随着ga3浓度升高，生菜pn先升高后降低，在ga3浓度为2.5μmol/l最高，与ck1相比提高了21.60％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为10μmol/l时，生菜pn最低，与ck和ck1相比分别降低了31.23％(p＜0.05)和12.49％(p＜0.05)。与pn变化趋势不同，生菜gs随ga3浓度升高而先降低后升高。在ga3浓度为2.5μmol/l时最低，与ck1相比降低了25.32％(p＜0.05)，但与ck相比无显著差异。cd胁迫下，与ck1相比，喷施低浓度(0～2.5μmol/l)的ga3显著降低了生菜ci，当ga3浓度为2.5μmol/l时最低，比ck1低11.23％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为5μmol/l和10μmol/l时，生菜ci虽比ck1稍高，但与ck1差异不显著。喷施ga3浓度为2.5μmol/l时，生菜tr与ck相比无显著差异。当ga3浓度为1μmol/l、5μmol/l和10μmol/l时，各处理间tr差异不显著，分别比ck1低9.24％(p＜0.05)、10.33％(p＜0.05)和7.61％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为1μmol/l、2.5μmol/l和5μmol/l时，与ck1相比差异显著，分别提高了24.43％、52.84％和12.50％。
表4ga3对cd胁迫下生菜光合作用的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜渗透调节物质及根系活力的影响
cd胁迫导致生菜mda含量显著升高，喷施低浓度的ga3(1～2.5μmol/l)后抑制了mda生成。当ga3浓度为5μmol/l和10μmol/l时，与ck1相比mda含量分别提高了6.31％(p＜0.05)和12.72％(p＜0.05)。cd胁迫下，当ga3浓度为2.5μmol/l(p＜0.05)时，生菜mda含量和电导率最低，分别比ck1低15.27％(p＜0.05)和12.62％(p＜0.05)。喷施1μmol/l、5μmol/l和10μmol/lga3的各处理，生菜电导率都显著低于ck1，分别降低了8.65％、5.74％和5.42％。喷施ga3后，生菜脯氨酸含量显著降低，但ga3各浓度处理的脯氨酸含量差异不显著。ga3处理的生菜根系活力由高到低依次为ck＞2.5μmol/l＞5μmol/l＞1μmol/l＞10μmol/l＞ck1。
表5ga3对cd胁迫下生菜渗透调节物质及根系活力的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜抗氧化酶活性的影响
从表6可以看出，cd胁迫下，随ga3浓度的升高，生菜pod活性先降低后急剧升高，在ga3浓度为2.5μmol/l时最低，与ck1相比降低了14.97％(p＜0.05)。与ck1相比，喷施ga3生菜sod含量显著降低，当ga3浓度为1μmol/l、2.5μmol/l、5μmol/l和10μmol/l时，分别降低了24.31％、27.22％、15.22％和11.04％。就cat活性而言，喷施1μmol/l、2.5μmol/l和5μmol/l的ga3各处理间无显著差异，分别比ck1高4.02％(p＞0.05)、9.24％(p＜0.05)和8.03％(p＜0.05)。当ga3浓度为10μmol/l时，生菜cat活性最低，与ck1相比差异不显著。
表6ga3对cd胁迫下生菜抗氧化酶活性的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜品质的影响
cd胁迫下，生菜可溶性糖含量随着ga3浓度的升高而先升高后降低，最大值出现在ga3浓度为2.5μmol/l时，与ck1相比，提高了6.75％(p＜0.05)。当ga3浓度为1μmol/l和5μmol/l时，生菜可溶性糖含量与ck1相比无显著差异。当ga3浓度为10μmol/l时，生菜可溶性糖含量显著低于ck1，降低了21.35％。生菜硝酸盐含量最低的处理为ga3浓度为1μmol/l时，与ck1相比，降低了45.55％(p＜0.05)，之后随着ga3浓度的升高，生菜硝酸盐含量持续升高。喷施ga3浓度为2.5μmol/l的处理硝酸盐含量虽比喷施ga3浓度为1μmol/l的处理稍低，但两者间差异不显著。与硝酸盐含量变化趋势相反，在ga3浓度为1μmol/l时，生菜可溶性蛋白含量达到最大值，与ck1相比，提高了31.42％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为2.5μmol/l、5μmol/l和10μmol/l的各处理间，可溶性蛋白含量间无显著差异。
表7ga3对cd胁迫下生菜品质的影响
外源ga3对cd胁迫下生菜cd含量及cd转运系数的影响
cd胁迫下，生菜地上部cd含量随ga3浓度升高而降低之后略有升高，当ga3浓度为5μmol/l时最低，为ck1的75.56％(p＜0.05)。喷施ga3浓度为10μmol/l时，生菜地上部cd含量与喷施ga3浓度为2.5μmol/l的处理差异不显著，但均显著低于ck1。喷施低浓度(0～2.5μmol/l)ga3对生菜根系cd含量无显著影响，高浓度(2.5～10μmol/l)时，生菜根系cd含量显著升高。喷施5μmol/l和10μmol/lga3，生菜根系cd含量分别为166.16mg/kg和162.17mg/kg，分别比ck1高12.65％和10.31％，均与ck1差异显著。当喷施ga3浓度为5μmol/l时，生菜cd转运系数最低，比对照低33.05％。
表8ga3对cd胁迫下生菜cd含量及cd转运系数的影响
ga3处理生菜生长、生理指标及cd含量之间的相关性分析
由表9可以看出，喷施ga3后，cd胁迫下生菜地上部cd含量与地上部鲜重，根系活力、可溶性糖含量和cat活性呈极显著负相关，与pod和sod活性呈极显著正相关。cd胁迫下，生菜地上部鲜重与mda含量呈显著负相关，与pod、sod活性极显著负相关，与根系活力、可溶性糖和cat活性呈正相关，且相关性极显著。
表9生菜生长、生理指标及cd含量之间的相关性分析
土壤cd污染会直接损伤植物根系细胞，抑制根系对养分的吸收，导致植物生长缓慢，叶片变黄坏死、植株矮小、产量下降。研究不同浓度cd对油菜幼苗生长的影响，发现随着cd浓度的增加，油菜幼苗生长受到抑制，生物量减少。也有研究表明随着cd浓度的增加，芥菜生长缓慢、地上部分生物量及相对含水量减少]。本试验研究结果发现，cd胁迫下导致生菜株高，茎粗和生物量显著降低。同时，cd胁迫显著降低了生菜根长和根系活力。cd胁迫下，生菜硝酸盐含量和可溶性蛋白含量显著升高，且硝酸盐含量与地上部cd含量呈显著正相关，说明土壤中cd浓度超标易导致蔬菜硝酸盐的积累。
植物在正常生理状况下，体内活性氧代谢水平处于相对稳定的状态。当受到cd胁迫时，细胞膜受到破坏，导致活性氧堆积，电解质大量外渗。研究表明cd还引起植物细胞的氧化应激反应，因为cd能有效触发活性氧簇的合成与积累，导致细胞损伤和膜脂过氧化，抑制或促进抗氧化系统中抗氧化酶的活性。高家合等认为cd胁迫在一定程度内能提高烤烟叶片sod和pod的活性，但并不能避免细胞膜脂过氧化的发生。本试验结果表明，cd胁迫导致生菜sod和pod活性升高，但cat活性降低。表明生菜sod和pod对cd的耐受力更强，在高浓度cd胁迫下，这两种酶活性仍然显著升高，而cat活性则被显著抑制。cd胁迫下，生菜电导率、脯氨酸含量和mda含量显著升高，表明高cd胁迫生菜细胞膜受到破坏导致膜脂过氧化，电解质外渗。
cd是光合作用的一种有效抑制剂。cd能通过降低叶绿素的含量、抑制卡尔文循环的反应步骤和酶的活性来降低pn、gs，改变叶绿体的超微结构，通过干扰原叶绿酸酯的生成来抑制叶绿素的形成、抑制电子传递链和光合碳代谢相关的酶活性等途径影响光合作用。本试验中，cd胁迫导致生菜叶绿素含量显著降低，pn显著下降，而ci升高，表明生菜光合速率降低是由非气孔因素导致的，cd胁迫使得光合相关酶活性降低及光合器官损伤。
在重金属胁迫下，植物体内叶绿素酸酯还原酶受到抑制，细胞内膜遭到破坏，从而影响了植物的光合作用、矿质元素的吸收及相关酶的活性，导致植物细胞分裂和伸长被抑制，生物量显著减少。
本研究结果表明，叶面喷施低浓度的ga3提高了cd污染土壤上生菜生物量和株高，且随ga3施用浓度的增加，生菜生物量和株高呈先增加后降低的趋势，尤其株高表现最为明显，喷施ga3浓度为2.5～10μmol/l的处理株高显著高于未受胁迫的ck。喷施ga3后，生菜pn升高，而ci和tr降低，表明ga3缓解了cd对生菜光合系统的破坏，同时降低了生菜的蒸腾作用。
本研究结果表明，适宜浓度ga3处理使生菜叶片pod和sod活性和mda含量降低，表明ga3有效缓解了细胞膜受伤害程度，降低了生菜的氧化胁迫，进而降低了对pod和sod的诱导。同时减轻了活性氧对叶绿体的破坏，在一定程度上延缓植株的衰老，提高碳氮代谢，从而促进了生菜的生长及产量，但当ga3浓度较高时，这种促进作用便会迅速减弱。
目前关于ga3调节植物吸收重金属的报道尚不多见。本发明中，低浓度的ga3抑制了cd向地上部转运，生菜地上部cd含量和转运系数均降低，但当ga3浓度超过5μmol/l后，生菜地上部cd含量和转运系数升高，表明适宜浓度的ga3可以抑制cd从根系向地上部分运输，可能原因是ga3可通过提高atp酶活性影响离子在细胞膜上的运输，促进植物光合速率，降低蒸腾速率，从而降低地上部分的cd含量。
对比实施例1
除了将脱落酸换为ckt，且浓度为1～200μmol/l之外，其余与实施例1一致。
经检测发现，在上述浓度范围内，玻璃生菜地上部分的镉含量，相对于ck1而言，最高仅下降1.2％。
对比实施例2
除了将脱落酸换为ja，且浓度为1～200μmol/l之外，其余与实施例1一致。
经检测发现，在上述浓度范围内，玻璃生菜地上部分的镉含量，相对于ck1而言，最高仅下降1.6％。
对比实施例3
除了将脱落酸换为ebr，且浓度为1～200μmol/l之外，其余与实施例1一致。
经检测发现，在上述浓度范围内，玻璃生菜地上部分的镉含量，相对于ck1而言，最高仅下降2.3％。
对比实施例4
除了将脱落酸换为脯氨酸，且浓度为1～200μmol/l之外，其余与实施例1一致。
经检测发现，在上述浓度范围内，玻璃生菜地上部分的镉含量，相对于ck1而言，最高仅下降1.4％。
对比实施例5
除了将脱落酸换为脱落酸(aba)，且浓度为1～20μmol/l之外，其余与实施例1一致。
如表10，施用脱落酸，不能缓解镉对生菜的生长抑制。
表10aba对cd胁迫下生菜生长的影响