本发明涉及植物组织培养技术领域，具体是一种紫玉兰的高效组织培养方法。
背景技术：
紫玉兰(magnolialilifloradesr.)又名辛夷，是木兰科落叶小乔木，高2~3m,分布在中国云南，福建，湖北，四川等地，生长于海拔300至1600米的地区，一般生长于山坡边缘。紫玉兰花朵艳丽怡人，芳香淡雅，孤植或丛植都很美观，是优良的庭园、街道绿化植物，又是中国传统的花卉和中药，但是紫玉兰不易移植和养护，已经被录入《世界自然保护联盟》植物红色名录，是非常珍贵的花木。
现在随着技术的发展，很多地区都在开展紫玉兰培养的方法，想在本地区培育种植紫玉兰。传统的紫玉兰一般采用播种、扦插、嫁接、压条和分株繁殖等培养方式。这些培养方式的耗时长，而且繁育不易成活。现有的一些紫玉兰组织培养方式是在封闭的无菌条件下进行的，所需成本较大，而且还存在着组织培养中外植体容易褐化，成活率不高的问题，不能用于紫玉兰的大量繁殖。
现有技术如授权公告号为cn103718966b的中国发明专利，紫玉兰组织培养方法，该紫玉兰组织培养方法是在开放式条件下进行，该方法其中包括对紫玉兰组织培养场地的灭菌抑菌处理、外植体的选择、外植体的灭菌消毒、外植体的初代培养，增殖培养和生根培养等步骤。上述方法并未解决紫玉兰外植体培育过程中容易褐化的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种外植体褐化率低，脱分化形成愈伤组织概率高的紫玉兰的高效组织培养方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：紫玉兰的高效组织培养方法，包括外植体消毒、愈伤组织的诱导培养、芽分化、继代增殖培养、二次生根和炼苗移栽。采用上述方法培育紫玉兰苗的时间短，外植体褐化率低，脱分化形成愈伤组织概率高，得到的紫玉兰苗病毒少、遗传性质稳定，叶片面积大，呈亮绿色，生命力旺盛，长出的根呈白色粗壮型，对水分和矿物质的吸收效率高。愈伤组织诱导培养步骤包括将外植体侧芽转移到添加0.7~1.5mg/l6-ba、0.08~0.15mg/liaa、2.5~3.5mg/l和0.7~1.8μg/l活性短肽的ms培养基中诱导芽的分化。采用上述方法诱导外植体脱分化生成愈伤组织，外植体切口处醌类物质含量非常低，褐化现象基本消失，得到的愈伤组织细胞排列紧密、质地较软，紫玉兰的存活率大幅提升。
作为优选，活性短肽的氨基酸序列为scasvcrgkrcgsifyrgrcycrclrc。上述活性短肽可在外植体切口处快速形成胶质，阻止紫玉兰体内多酚类物质的渗出，同时上述活性多肽具有较强的抗氧化性，可防止多酚类物质被氧化成醌类物质，因此外植体切口处醌类物质的含量非常低。
作为优选，外植体消毒步骤为先用65~85%酒精浸泡紫玉兰侧芽20~40s，再用无菌水冲洗干净，用0.06~0.13%的hgcl2消毒3~15min，无菌水冲洗5~8次。将渗透性较强的酒精和渗透性弱的升汞配合使用，消毒效果好。
作为优选，芽分化步骤为将愈伤组织转移到消毒完的外植体接种于以果糖或葡萄糖为碳源，添加ba0.3~0.6mg/l和naa0.008~0.014mg/l的ms培养基中培养。上述方法中愈伤组织再分化率高，4~8d外植体切口处出现绿色凸起，再培养15~25d出现丛生芽。
作为优选，继代增殖培养步骤为将丛生芽以2~4个芽的基数分开，添加转入0.32~0.43mg/lzt、2.0~3.2mg/l2,4-d、5.2~6.5g/l琼脂和23~34g/l蔗糖的ms培养基中培养。上述方法可得到大量的无根苗，无根苗叶片面积大，呈亮绿色，生命力旺盛；由同一个外植体得到，遗传性状稳定，可很好的保持亲本的优良性状。
作为优选，二次生根步骤为将无根苗先转移到添加0.08~0.14mg/l6-ba和1.5~2.6mg/lnaa的ms培养基中，培养15~24d后转入不添加任何激素的1/2ms培养基中培养。上述方法能加快紫玉兰无根苗的生根速度，并且长出的根呈白色粗壮型，对水分和矿物质的吸收效率高。
作为优选，炼苗移栽步骤包括待紫玉兰试管苗在培养瓶中培养至长有6片以上叶子和发达的根系后，先敞口炼苗1.5~2.5d，再在添加0.04~0.06mg/liba、0.04~0.06mg/lnaa、12~16g/l蔗糖的1/8ms培养基中浸根1.5~2.5d后洗净根部，将苗转入装有土沙，并浇有1/30~1/15ms的盆中，沙土中加入草木灰。试管苗叶片表面的角质层已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失，但抗应激性弱，上述方法可提高紫玉兰苗茎秆强度，增强抗猝能力。
炼苗移栽步骤包括紫玉兰苗在25~30℃环境下培养，每隔1~2d浇一次水，4~6d后移入阳光下培养。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1.采用上述方法培育紫玉兰苗的时间短，外植体褐化率低，脱分化形成愈伤组织概率高，得到的紫玉兰苗病毒少、遗传性质稳定，叶片面积大，呈亮绿色，生命力旺盛，长出的根呈白色粗壮型，对水分和矿物质的吸收效率高。
2.在愈伤组织的诱导培养中加入氨基酸序列为scasvcrgkrcgsifyrgrcycrclrc的活性短肽。上述活性短肽可在外植体切口处快速形成胶质，阻止紫玉兰体内多酚类物质的渗出，同时上述活性多肽具有较强的抗氧化性，可防止多酚类物质被氧化成醌类物质，因此外植体切口处醌类物质的含量非常低。
具体实施例
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
紫玉兰的高效组织培养方法，包括外植体消毒、愈伤组织的诱导培养、芽分化、继代增殖培养、二次生根和炼苗移栽。采用上述方法培育紫玉兰苗的时间短，外植体褐化率低，脱分化形成愈伤组织概率高，得到的紫玉兰苗病毒少、遗传性质稳定，叶片面积大，呈亮绿色，生命力旺盛，长出的根呈白色粗壮型，对水分和矿物质的吸收效率高。愈伤组织诱导培养步骤包括将外植体侧芽转移到添加1.1mg/l6-ba、0.13mg/liaa、2.8mg/l和1.2μg/l活性短肽的ms培养基中诱导芽的分化。采用上述方法诱导外植体脱分化生成愈伤组织，外植体切口处醌类物质含量非常低，褐化现象基本消失，得到的愈伤组织细胞排列紧密、质地较软，紫玉兰的存活率大幅提升。
活性短肽的氨基酸序列为scasvcrgkrcgsifyrgrcycrclrc。上述活性短肽可在外植体切口处快速形成胶质，阻止紫玉兰体内多酚类物质的渗出，同时上述活性多肽具有较强的抗氧化性，可防止多酚类物质被氧化成醌类物质，因此外植体切口处醌类物质的含量非常低。
外植体消毒步骤为先用80%酒精浸泡紫玉兰侧芽20s，再用无菌水冲洗干净，用0.1%的hgcl2消毒6min，无菌水冲洗6次。将渗透性较强的酒精和渗透性弱的升汞配合使用，消毒效果好。
芽分化步骤为将愈伤组织转移到消毒完的外植体接种于以果糖或葡萄糖为碳源，添加ba0.4mg/l和naa0.011mg/l的ms培养基中培养。上述方法中愈伤组织再分化率高，7d外植体切口处出现绿色凸起，再培养22d出现丛生芽。
继代增殖培养步骤为将丛生芽以3个芽的基数分开，添加转入0.39mg/lzt、2.8mg/l2,4-d、6.1g/l琼脂和29g/l蔗糖的ms培养基中培养。上述方法可得到大量的无根苗，无根苗叶片面积大，呈亮绿色，生命力旺盛；由同一个外植体得到，遗传性状稳定，可很好的保持亲本的优良性状。
二次生根步骤为将无根苗先转移到添加0.12mg/l6-ba和2.2mg/lnaa的ms培养基中，培养22d后转入不添加任何激素的1/2ms培养基中培养。上述方法能加快紫玉兰无根苗的生根速度，并且长出的根呈白色粗壮型，对水分和矿物质的吸收效率高。
炼苗移栽步骤包括待紫玉兰试管苗在培养瓶中培养至长有6片以上叶子和发达的根系后，先敞口炼苗2d，再在添加0.05mg/liba、0.05mg/lnaa、14g/l蔗糖的1/8ms培养基中浸根2d后洗净根部，将苗转入装有土沙，并浇有1/20ms的盆中，沙土中加入草木灰。试管苗叶片表面的角质层已形成，可有效抵抗低强度的光线照射及减少水分散失，但抗应激性弱，上述方法可提高紫玉兰苗茎秆强度，增强抗猝能力。
炼苗移栽步骤包括紫玉兰苗在28℃环境下培养，每隔1~2d浇一次水，4~6d后移入阳光下培养。
实施例2：
紫玉兰的高效组织培养方法，包括以下步骤：
1）外植体消毒：先用75%酒精浸泡紫玉兰侧芽30s，再用无菌水冲洗干净，用0.1%的hgcl2消毒7min，无菌水冲洗6次；
2）愈伤组织诱导培养：将外植体侧芽转移到添加1mg/l6-ba、0.1mg/liaa和1.5μg/l活性短肽的ms培养基中诱导芽的分化，于25℃，光照2000lx条件下培养18d。活性短肽的氨基酸序列为scasvcrgkrcgsifyrgrcycrclrc；
3）芽分化：将愈伤组织转移到消毒完的外植体接种于以果糖或葡萄糖为碳源，添加ba0.5mg/l和naa0.01mg/l的ms培养基中培养。在25℃，光照2000lx条件下培养6d后切口部分出现绿色凸起，再培养20d出现丛生芽，再培养5d丛生芽长到2~4cm；
4）继代增殖培养：将丛生芽以3个芽的基数分开，转入添加0.4mg/lzt、2.5mg/l2,4-d、6g/l琼脂和30g/l蔗糖的ms培养基中，并于25℃，光照2000lx条件下培养10d；
5）二次生根：将无根苗先转移到添加0.1mg/l6-ba和2mg/lnaa的ms培养基中，暗培养20d后转入不添加任何激素的1/2ms培养基中继续暗培养14d；
6）炼苗移栽：待紫玉兰试管苗在培养瓶中培养至长有6片以上叶子和发达的根系后，先敞口炼苗2d，再在添加0.05mg/liba、0.05mg/lnaa、14g/l蔗糖的1/8ms培养基中浸根2d后洗净根部，将苗转入装有土沙，并浇有1/20ms的盆中，沙土中加入草木灰。炼苗移栽步骤包括紫玉兰苗在27℃环境下培养，每隔1~2d浇一次水，4~6d后移入阳光下培养。
实施例3：
紫玉兰的高效组织培养方法，包括以下步骤：
1）外植体消毒：先用70%酒精浸泡紫玉兰侧芽40s，再用无菌水冲洗干净，用0.1%的hgcl2消毒7min，无菌水冲洗7次；
2）愈伤组织诱导培养：将外植体侧芽转移到添加0.9mg/l6-ba、0.12mg/liaa和1.1μg/l活性短肽的ms培养基中诱导芽的分化，于25℃，光照2500lx条件下培养19d。活性短肽的氨基酸序列为scasvcrgkrcgsifyrgrcycrclrc；
3）芽分化：将愈伤组织转移到消毒完的外植体接种于以果糖或葡萄糖为碳源，添加ba0.48mg/l和naa0.009mg/l的ms培养基中培养。在25℃，光照2500lx条件下培养6d后切口部分出现绿色凸起，再培养23d出现丛生芽，再培养5d丛生芽长到2~4cm；
4）继代增殖培养：将丛生芽以3个芽的基数分开，转入添加0.38mg/lzt、2.2mg/l2,4-d、6g/l琼脂和30g/l蔗糖的ms培养基中，并于25℃，光照2500lx条件下培养10d；
5）二次生根：将无根苗先转移到添加0.1mg/l6-ba和2mg/lnaa的ms培养基中，暗培养20d后转入不添加任何激素的1/2ms培养基中继续暗培养14d；
6）炼苗移栽：待紫玉兰试管苗在培养瓶中培养至长有6片以上叶子和发达的根系后，先敞口炼苗2d，再在添加0.047mg/liba、0.047mg/lnaa、14g/l蔗糖的1/8ms培养基中浸根2d后洗净根部，将苗转入装有土沙，并浇有1/20ms的盆中，沙土中加入草木灰。炼苗移栽步骤包括紫玉兰苗在27℃环境下培养，每隔1~2d浇一次水，4~6d后移入阳光下培养。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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