本发明属于植物生物技术领域，特别涉及一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法。
背景技术：
黄石斛（dendrobiumtosaensemakino）属于兰科石斛属，仅产于我国江西、广东、台湾及日本等地，常被误认为铁皮石斛，在日本和台湾已被作为中药材广泛应用，产量比铁皮石斛产量高，具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管等作用；同时，黄石斛花朵黄绿色，具有较高的观赏价值，可应用于盆栽观赏，具有广阔的应用前景。但由于黄石斛种源稀缺，严重地制约了其产业的发展。
目前世界上还没有黄石斛种苗繁殖专利和文献报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，包括下列步骤：
第一步：将黄石斛蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水漂洗后切开，将黄石斛种子洗脱至一装有无菌水的容器内制成种子悬浮液；
第二步：无菌条件下，将所述种子悬浮液移至装有90-100毫升的含有种子萌发固体培养基的培养容器内进行培养，得到1-2厘米长度的黄石斛苗；其中：所述种子萌发固体培养基为改进ms培养基，在改进ms培养基的基础上添加0.1-0.2毫克/升的萘乙酸、0.5-1.0克/升的活性碳、15-20克/升的蔗糖、6-7克/升的琼脂，所述改进ms培养基还添加有改进ms培养基质量的10-20%的椰子汁；所述改进ms培养基为大量元素减半的ms培养基；所述种子萌发固体培养基的ph值为5.4-5.6；
第三步：将所述黄石斛苗接种培养到成苗培养基上进行培养，得到黄石斛植株，每升所述成苗培养基含有花宝1号1-2克、花宝2号1-2克、蛋白胨0.5-2克、土豆泥40-80克、香蕉泥50-100克、活性碳0.5-1.0克、肌醇80-120毫克、甘氨酸1.5~2.5毫克、盐酸硫胺素0.05-0.2毫克、盐酸吡哆醇0.4-0.8毫克、烟酸0.4-0.8毫克、6-苄基腺嘌呤0.5-1.0毫克、萘乙酸0.5-1.0毫克、蔗糖20-30毫克、琼脂6-7毫克，所述成苗培养基的ph值为5.4-5.6；
第四步：将所述黄石斛植株连同成苗培养基转移到具有自然光的温室中炼苗10-15天，然后洗净根部的成苗培养基，接下来以苔藓为栽培基质进行培养。
优选的技术方案为：将黄石斛蒴果用体积浓度为70-80%的酒精浸泡30-60秒。
优选的技术方案为：用质量百分比浓度为0.1-0.2%的升汞溶液消毒10-20分钟。
优选的技术方案为：每个所述培养容器内容纳有200-400粒黄石斛种子。
优选的技术方案为：在第二步中，培养的条件为：温度24-26℃、光照度1500-2000lx、光照时间为10-12小时/天。
优选的技术方案为：在第三步中，培养的条件为：培养温度26-28℃，光照度2000-3000lx，光照时间为12-14小时/天。
优选的技术方案为：所述苔藓用水浸泡24-48小时后作为栽培基质。
上述技术方案中：所述ms培养基是murashige和skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。基于此，这种培养基就用他们的名字来命名了。大量元素是指：nh4no3、kno3、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明采用成熟的蒴果进行无菌播种、两次培养成苗，具有繁殖速度快、种苗品质优良、生长成本低等特点，只需要简单的组织培养设备就可以完成。
具体实施方式
以下对本发明之实施方式做更详细的说明，使熟悉该项技艺者在阅读本说明书后能据以实施。
本文中使用的术语的目的仅在于说明特别实施例，并不意图对本发明做限制。除非上下文明确显示，否则本文中使用的单数形式“一”、“一个”、“该”亦旨在包括复数形式。
在说明较佳实施例时，可能基于清楚的目的而使用特别的术语；然而，本说明书所揭露者并不意图被限制在所选择的该特别术语；并且应当理解，每一个特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并达成相似效果的所有等效技术。
实施例1：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法
（1）材料：开花时选取生长健壮的黄石斛进行人工授粉，授粉后150天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。
（2）种子悬浮液制备：将黄石斛蒴果用体积浓度为70%的酒精浸泡30秒后，再用质量百分比浓度为0.1%的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水漂洗4次后切开果实，将粉末状基本成熟的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，制成种子悬浮液。对每个黄石斛蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为60粒/毫升的接种用的种子悬浮液。
（3）无菌播种：
无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液5毫升至装有90毫升的含有种子萌发固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶黄石斛的种子数量300粒。所述种子萌发固体培养基为改进ms培养基，在改进ms培养基的基础上添加0.1毫克/升的萘乙酸（即每升改进ms培养基添加0.1毫克的萘乙酸）、0.5/升的活性碳、15克/升的蔗糖、6克/升的琼脂，所述改进ms培养基还添加有改进ms培养基质量的10的椰子汁；所述改进ms培养基为大量元素减半的ms培养基；所述种子萌发固体培养基的ph值为5.4.在实验中所采用的培养温度24℃，光照度1500lx，光照10小时/天。种子10天开始萌发，萌发率90%，苗生长均匀统一，90天时苗高1厘米左右。
（4）成苗培养：将无菌播种获得的1厘米小苗接种培养到成苗培养基上培养，成苗培养基为花宝1号1克/升，花宝2号1克/升，蛋白胨0.5克/升，土豆泥40克/升，香蕉泥50克/升，活性碳0.5克/升，肌醇80毫克/升，甘氨酸1.5毫克/升，盐酸硫胺素（vb1）0.05毫克/升，盐酸吡哆醇（vb6）0.4毫克/升，烟酸0.4毫克/升，6-苄基腺嘌呤（6-ba）0.5毫克/升，萘乙酸（naa）0.50毫克/升，蔗糖20克/升，琼脂7克/升，ph5.4-5.6。60天时能形成高4厘米的健壮的植株，每个植株带2个丛生芽。
（5）试管苗移栽：春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具4厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用用水浸泡24小时的进口苔藓为栽培基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹每丛的根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90%。
实施例2：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法
（1）材料：开花时选取生长健壮的黄石斛进行人工授粉，授粉后160天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。
（2）种子悬浮液制备：将蒴果用75%的酒精浸泡40秒后0.15％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状基本成熟的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，制成种子悬浮液。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为50粒/毫升的接种用的种子悬浮液。
（3）无菌播种：
无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液5毫升至装有95毫升的含有种子萌发固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶黄石斛的种子数量300粒。所述种子萌发固体培养基为改进ms培养基，在改进ms培养基的基础上添加0.15毫克/升的萘乙酸、0.75克/升的活性碳、18克/升的蔗糖、7克/升的琼脂，所述改进ms培养基还添加有改进ms培养基质量的15%的椰子汁；所述改进ms培养基为大量元素减半的ms培养基；所述种子萌发固体培养基的ph值为5.5。在实验中所采用的培养温度25℃，光照度1800lx，光照11小时/天。种子13天开始萌发，萌发率93%，苗生长均匀统一，100天时苗高1.5厘米。
（4）成苗培养：将无菌播种获得的1.5厘米小苗接种培养到成苗培养基上培养，成苗培养基为花宝1号1.5克/升，花宝2号1.5克/升，蛋白胨1.0克/升，土豆泥60克/升，香蕉泥75克/升，活性碳0.75克/升，肌醇100毫克/升，甘氨酸2.0毫克/升，盐酸硫胺素（vb1）0.1毫克/升，盐酸吡哆醇（vb6）0.6毫克/升，烟酸0.6毫克/升，6-苄基腺嘌呤（6-ba）0.75毫克/升，萘乙酸（naa）0.75毫克/升，蔗糖25毫克/升，琼脂6.5毫克/升，ph5.5。80天时能形成高5厘米的健壮的植株，每个植株带2.5个丛生芽。在实验中所采用的培养温度27℃，光照度2500lx，光照13小时/天。
（5）试管苗移栽：春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具5厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗13天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用用水浸泡36小时的进口苔藓为栽培基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹每丛的根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达93%。
实施例3：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法
（1）材料：开花时选取生长健壮的黄石斛进行人工授粉，授粉后180天选择种子基本成熟而未开裂的蒴果为外植体用于无菌播种。
（2）种子悬浮液制备：将蒴果用80%的酒精浸泡60秒后0.2％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水漂洗6次后切开果实，将粉末状基本成熟的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，制成种子悬浮液。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为40粒/毫升的接种用的种子悬浮液。
（3）无菌播种：
无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液7毫升至装有100毫升的含有种子萌发固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶黄石斛的种子数量280粒。所述种子萌发固体培养基为改进ms培养基，在改进ms培养基的基础上添加0.2毫克/升的萘乙酸、1.0克/升的活性碳、20克/升的蔗糖、6.5克/升的琼脂，所述改进ms培养基还添加有改进ms培养基质量的120%的椰子汁；所述改进ms培养基为大量元素减半的ms培养基；所述种子萌发固体培养基的ph值为5.6。在实验中所采用的培养温度26℃，光照度2000lx，光照12小时/天。种子15天开始萌发，萌发率95%，苗生长均匀统一，120天时苗高2厘米。
（4）成苗培养：将无菌播种获得的2厘米小苗接种培养到成苗培养基上培养，成苗培养基为花宝1号2克/升，花宝2号2克/升，蛋白胨2克/升，土豆泥80克/升，香蕉泥100克/升，活性碳1.0克/升，肌醇120毫克/升，甘氨酸2.5毫克/升，盐酸硫胺素（vb1）0.2毫克/升，盐酸吡哆醇（vb6）0.8毫克/升，烟酸0.8毫克/升，6-苄基腺嘌呤（6-ba）1.0毫克/升，萘乙酸（naa）1.0毫克/升，蔗糖30克，琼脂6克，ph5.6。90天时能形成高6厘米的健壮的植株，每个植株带3个丛生芽。
（5）试管苗移栽：春季和秋季是试管苗出瓶的适宜时期，将具6厘米高完整植株将培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用用水浸泡48小时的进口苔藓为栽培基质，种植时将苔藓的水分拧干，包裹每丛的根系基地种植于穴盘中，保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达95%。
实施例4：一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法
一种黄石斛种苗无菌播种快速繁殖方法，包括下列步骤：
第一步：将黄石斛蒴果用酒精浸泡，然后用升汞溶液消毒，再用无菌水漂洗后切开，将黄石斛种子洗脱至一装有无菌水的容器内制成种子悬浮液；
第二步：无菌条件下，将所述种子悬浮液移至装有95毫升的含有种子萌发固体培养基的培养容器内进行培养，得到1.5厘米长度的黄石斛苗；其中：所述种子萌发固体培养基为改进ms培养基，在改进ms培养基的基础上添加0.18毫克/升的萘乙酸、0.89克/升的活性碳、17.8克/升的蔗糖、6.34克/升的琼脂，所述改进ms培养基还添加有改进ms培养基质量的11.7%的椰子汁；所述改进ms培养基为大量元素减半的ms培养基；所述种子萌发固体培养基的ph值为5.5；
第三步：将所述黄石斛苗接种培养到成苗培养基上进行培养，得到黄石斛植株，每升所述成苗培养基含有花宝1号1克、花宝2号2克、蛋白胨2克、土豆泥49克、香蕉泥70克、活性碳0.5克、肌醇120毫克、甘氨酸2.5毫克、盐酸硫胺素0.2毫克、盐酸吡哆醇0.8毫克、烟酸0.4毫克、6-苄基腺嘌呤0.5毫克、萘乙酸1.0毫克、蔗糖20毫克、琼脂7毫克，所述成苗培养基的ph值为5.6；
第四步：将所述黄石斛植株连同成苗培养基转移到具有自然光的温室中炼苗15天，然后洗净根部的成苗培养基，接下来以苔藓为栽培基质进行培养。
优选的实施方式为：将黄石斛蒴果用体积浓度为75%的酒精浸泡60秒。
优选的实施方式为：用质量百分比浓度为0.2%的升汞溶液消毒10分钟。
优选的实施方式为：每个所述培养容器内容纳有400粒黄石斛种子。
优选的实施方式为：在第二步中，培养的条件为：温度26℃、光照度2000lx、光照时间为10小时/天。
优选的实施方式为：在第三步中，培养的条件为：培养温度26℃，光照度3000lx，光照时间为12小时/天。
优选的实施方式为：所述苔藓用水浸泡24小时后作为栽培基质。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。