本发明涉及退化食用菌菌株复壮技术领域，具体是一种蛹虫草复壮育种工艺。
背景技术：
栽培食用菌，需要获得高产，菌株是关键。蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属的模式种。蛹虫草又名北冬虫夏草、北蛹虫草，是冬虫夏草的同属近缘种，其有效组分与冬虫夏草类似，含有核苷类、多糖类、甾醇类以及sod酶等，且虫草素含量更是高于冬虫夏草，具有提高机体免疫力、抗肿瘤、防衰老、保护心肺组织、镇静催眠等多种药理作用。因此，蛹虫草作为冬虫夏草替代品用在保健药品和食品上，市场需求量大。
近些年来，我国人工栽培蛹虫草的关键技术得以突破，使得大规模人工培养蛹虫草得以实现。然而在生产栽培和实践过程中，必然会遇到菌种的衰退或退化问题，使菌种的优良性状在一定程度上衰退或丧失。蛹虫草菌株的衰退主要表现在，菌丝生长速度减慢，菌丝稀疏，子实体产生率低或子实体个体矮小，畸变，发酵过程中，所需代谢产物的产量大幅降低等现象。
导致微生物菌株的衰退是多方面原因引起，可以是由自发突变的量变到质变的产生，可以是由环境因素不适宜导致发生变异，或者是由它种微生物的侵袭所导致，或者保藏方式不当，一味的移接、传代，而使群体中的负变异不断扩大等诸方面原因所造成。退化具体表现为：出现菌丝稀疏、生长速度变慢、粉孢子增多、子实体形成率低、畸形量多、代谢产物虫草素的含量降低等现象。
微生物菌株衰退后，需要采取复壮的方法来恢复其原有的优良性状，通常采用的方法是进行纯种分离后测定其典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，或通过其它的实验手段进行复壮，使退化菌株恢复原有优良性状。
现阶段，食用菌的复壮主要方法有以下几种：
1.组织分离：是将退化菌株出菇后，选择相对出菇时间早，子实体外观健壮，抗病能力强等性状的子实体采摘下来，在无菌条件下用pda培养基进行组织分离。分离获得的菌株，经生物学性能测定，选择出优良性状的菌株，进行出菇试验，若出菇后的子实体能恢复原有性状，将其分离后的菌株可作为后续栽培原种使用；若出菇后的子实体还未回复原有性状，则必须再次进行组织分离复壮。
2.菌丝纯化与尖端菌丝分离：挑取健壮的菌丝体顶端部分，进行纯化培养，使菌丝恢复以保持菌种的纯度，使菌种恢复原来生命力和优良性状，达到复壮的目的。
3.有性孢子分离筛选：选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，采用孢子收集器收集有性孢子，进行多孢或单孢分离培养。获得的单核菌丝，还需和另一可亲和的单核菌丝杂交后形成双核菌丝，再进行出菇培养。孢子分离需要反复试验，出菇性能好的，才能作为优良菌株投入生产栽培中。
在蛹虫草工厂化栽培的过程中如何解决菌种衰退，菌丝体生长速度减慢，菌丝稀疏，粉孢子量增多，子实体形成率降低或子实体个体矮小，畸形以及发酵过程中，所需代谢产物的产量大幅降低等问题，己经成为蛹虫草工厂化栽培的关键问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简单易行、效果显著的蛹虫草复壮育种工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养；
(2)将活化后的蛹虫草菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养3-5d；
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，20-25℃培养40-50d左右；
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，20-23℃培养5-10d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养30-40d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4)步操作2-3次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤(2)中种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(3)中栽培培养基为：小麦或大米30-50g/瓶，水40-70ml/瓶。
作为本发明再进一步的方案：所述蛹虫草菌株为蛹虫草弘侨1#菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明不必使用孢子收集器，简化操作，节约了育种成本；其次，由于是单孢子纯化复壮，因此可保证菌种的纯度，定向筛选出性状稳定的优良菌种，作为栽培原种，适用于由于自发突变以及环境因素不适宜而导致菌种退化的菌株复壮。本发明突破了传统的菌株复壮方法，采用孢子弹射法对菌株进行复壮，此方法操作容易，简单易行，且效果显著。经过此种方法复壮后的菌株，其菌丝粗壮，致密，生长速度相较于复壮前有了较大的提高，在固体栽培中，子实体形成率大幅提高，个体大小较均匀，畸形率降低，相较于传统复壮方法而言，此方法更加有效简单易于操作，实用性强。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草弘侨1#菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养8d；所述pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
(2)将活化后的蛹虫草弘侨1#菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养3d；所述种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，20℃培养40d左右；栽培培养基为：小麦或大米30g/瓶，水40ml/瓶。
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，20℃培养5d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养30d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4)步操作2次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
实施例2
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草弘侨1#菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养8d；所述pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
(2)将活化后的蛹虫草弘侨1#菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养3.5d；所述种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，21℃培养42d左右；栽培培养基为：小麦或大米35g/瓶，水50ml/瓶。
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，21℃培养6d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养32d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4)步操作3次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
实施例3
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草弘侨1#菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养8d；所述pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
(2)将活化后的蛹虫草弘侨1#菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养4d；所述种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，22℃培养45d左右；栽培培养基为：小麦或大米40g/瓶，水55ml/瓶。
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，22℃培养8d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养35d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4)步操作2次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
实施例4
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草弘侨1#菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养8d；所述pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
(2)将活化后的蛹虫草弘侨1#菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养4.5d；所述种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，24℃培养48d左右；栽培培养基为：小麦或大米45g/瓶，水60ml/瓶。
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，22℃培养9d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养38d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4)步操作3次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
实施例5
一种蛹虫草复壮育种工艺，具体步骤如下：
(1)将退化的蛹虫草弘侨1#菌株接种于pda斜面培养基中，23℃进行活化培养；所述pda斜面培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂15g/l，ph自然。
(2)将活化后的蛹虫草弘侨1#菌株接种于摇瓶培养基中，23℃培养5d；所述种子培养基为：土豆200g/l，蔗糖20g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1g/l，蛋白胨3g/l，vb1为10mg/l。
(3)将培养好的摇瓶种子液，接种于小麦或大米栽培培养基上，25℃培养50d左右；栽培培养基为：小麦或大米50g/瓶，水70ml/瓶。
(4)选择形态好，生长健壮的八成熟的子实体，截取尖端悬挂于栽培培养基瓶盖上，23℃培养10d，至培养基表面孢子萌发透彻，取出子实体尖端，继续培养40d；同时观察菌丝生长速度，产子实体能力；
(5)继续重复(4).步操作2次，同时将培养成熟的蛹虫草采摘烘干，检测其主要有效成分虫草素，直至性状稳定即作为栽培原种使用。
实施例中使用的蛹虫草弘侨1#菌株，由辽宁弘侨生物科技股份有限公司育种研发中心提供。
本发明不必使用孢子收集器，简化操作，节约了育种成本；其次，由于是单孢子纯化复壮，因此可保证菌种的纯度，定向筛选出性状稳定的优良菌种，作为栽培原种，适用于由于自发突变以及环境因素不适宜而导致菌种退化的菌株复壮。本发明突破了传统的菌株复壮方法，采用孢子弹射法对菌株进行复壮，此方法操作容易，简单易行，且效果显著。经过此种方法复壮后的菌株，其菌丝粗壮，致密，生长速度相较于复壮前有了较大的提高，在固体栽培中，子实体形成率大幅提高，个体大小较均匀，畸形率降低，相较于传统复壮方法而言，此方法更加有效简单易于操作，实用性强。
实验结果显示，复壮后的菌株，其菌丝生长速度较复壮前大幅提高，菌丝体粗壮，致密；复壮后的菌株接种于固体培养基上，子实体形成率大幅提高，个体大小较均匀，畸形率降低；子实体中虫草素含量约为复壮前的4.5-6.5倍。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。