本发明涉及生物发酵领域，具体涉及一种冠突散囊菌固态发酵银杏叶的方法及其应用。
背景技术：
冠突散囊菌，俗称为“金花”菌，属于散囊菌目、发菌科、散囊属的一种真菌，菌体呈金黄色。茯砖茶在“发花”的过程中，冠突散囊菌是贯穿整个过程的优势菌。茯砖茶的独特品质以及别具风味，冠突散囊菌功不可没。在国家标准中，茯砖茶也是黑茶品种中唯一有“冠突散囊菌”这一指标的茶类品种。冠突散囊菌的研究始于上世纪50年代，最初冠突散囊菌被认为是黄霉菌，之后又被认定为谢瓦氏曲霉，由于当时的研究条件十分有限，其命名一直没能得到准确的认定。多年后，通过电镜扫描的结果发现，冠突散囊菌的表面实际上十分粗糙，但谢瓦氏曲霉的表面是光滑的，所以，认为冠突散囊菌是谢瓦氏曲霉的命名并不成立。1990年齐祖同等根据冠突散囊菌子囊孢子自身的特征，按照有性方式命名的原则，对其重新命名，将“冠突曲霉”改为“冠突散囊菌”。
银杏原产中国，中国银杏资源拥有量占世界总量的70％以上。1965年，德国科学家w.scheabe首先发现银杏叶中的有效成分可以降低胆固醇含量，世界范围内迅速形成了一股银杏叶活性成分及其药理药效作用的研究热潮。银杏叶中具有多种药用价值的天然活性成分，主要有黄酮类化合物、萜内酯类化合物、聚异戊烯醇类化合物、酚酸类化合物、原花青素等。银杏叶提取物在治疗脑血栓、冠心病、脑功能障碍、神经系统疾病的氧自由基清除等心脑血管疾病方面具有独特疗效。
最初在饲料中添加抗生素的举措大大促进了生产，而现在由于滥用抗生素从而引起食品安全问题，禁止在饲料中添加抗生素。让饲料行业不得不转向研究新型饲料，来代替原有的饲料，因此发酵饲料的研究就应运而生。发酵饲料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂和原料，将饲料通过发酵作用从而转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽、微生物活性益生菌、复合酶制剂为一体的生物发酵饲料。在人工控制的条件下，微生物通过自身的代谢活动，将植物性、动物性和矿物质性物质中的抗营养因子分解或转化，从而产生更加容易被畜禽采食、消化或吸收且无毒害作用的饲料原料。
曹福亮等研究了银杏叶生物饲料添加剂对黄羽肉仔鸡生长及免疫的影响，结果表明：(1)银杏叶生物饲料添加剂对肉仔鸡增重有明显促进作用，添加1.0％组和0.5％组的末重分别比对照组提高5.56％和5.02％，平均日增重分别提高5.74％和5.19％；添加1.0％组和0.5％组间的末重、平均日增重差异不显著，添加1.5％组和对照组间的末重、平均日增重差异也不显著。从添加水平看，以添加1.0％为佳；(2)银杏叶生物饲料添加剂对脾脏、胸腺和法氏囊等免疫器官的相对质量产生了一定的影响。
南京林业大学赵林果课题组在银杏叶生物发酵方面，研究了细菌地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌，酵母菌产朊假丝酵母和真菌黑曲霉对银杏叶的发酵情况，并考察了发酵前后理化、功能成分的变化。北京中医药大学岳秉飞课题组优化了冠突散囊菌发酵银杏叶的条件，并对发酵产物的抗氧化活性、抑菌活性进行了考察。陕西科技大学秦俊哲课题组考察了冠突散囊菌发酵银杏叶制备银杏茶，研究了发酵条件和相关成分的变化。就上述研究现状来看，当前冠突散囊菌发酵银杏叶存在以下问题：(1)发酵目标定位方面主要是制备银杏叶茶或期望通过发酵获得新的生物活性物质，没有就冠突散囊菌发酵银杏叶作为饲料或饲料添加剂进行考察；(2)现有报道中发酵培养基仅以银杏叶粉为原料配置，缺乏可发酵碳源、氮源，冠突散囊菌生长受限，最终发酵产物中冠突散囊菌孢子数少；(3)没有就冠突散囊菌发酵银杏叶过程中消化酶类的消长情况进行研究。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种冠突散囊菌固态发酵银杏叶的方法，该方法使银杏叶通过冠突散囊菌发酵后，各营养、功能成分如蛋白质、黄酮类化合物、聚异戊烯醇类化合物增加，有害成分银杏酚酸含量减少。同时使发酵银杏叶富含冠突散囊菌孢子和各种消化酶类。此外由于果胶、纤维素和木质素等的降解，使得发酵银杏叶的口感细腻，发酵银杏叶作为饲料或者添加到饲料中增加了饲料的适口性；有利于动物对饲料的吸收，提高饲喂效果。
本发明的另一个目的是提供了上述方法制备的冠突散囊菌固态发酵的银杏叶在制备生物发酵型饲料或饲料添加剂中的应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种冠突散囊菌固态发酵银杏叶的方法，包括如下步骤：
(1)将采摘的银杏叶去杂、洗净、烘干、粉碎，得到银杏叶粉末置于容器中；
(2)向容器中继续加入粉碎后的辅料，再加入缓冲液混匀，高温高压灭菌，得银杏叶固态发酵培养基冷却后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得的银杏叶固态发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，进行发酵，得到冠突散囊菌发酵银杏叶。
其中，步骤(1)所述的银杏叶粉末与步骤(2)所述的缓冲液的质量比为8-9：2.5-7.5。最优选的银杏叶粉末与的缓冲溶液的质量比为8.5：5。
其中，步骤(2)所述的辅料为玉米粉、米糠、豆饼、菜籽饼、花生饼、棉籽饼、葵花籽饼、酒糟、大麦全粉、小麦全粉、木薯粗粉、马铃薯粉、甘薯粉、橡子粉、银杏果仁粉、银杏果全粉中的一种或几种。
其中，步骤(2)所述辅料的质量为银杏叶粉末和缓冲溶液总质量的4-7％。最优选的辅料的质量为银杏叶粉末和缓冲溶液总质量的5％。
其中，步骤(2)所述缓冲溶液的ph为4-5。最优选的缓冲溶液为ph4.5的磷酸盐缓冲溶液。
其中，步骤(3)所述冠突散囊菌孢子悬液接种到银杏叶固态发酵培养基后孢子数和固态发酵培养基的比为0.4×106-0.7×106cfu/g。
其中，步骤(3)所述发酵的时间为4-9天，温度为26-32℃，相对湿度为75-90％。
本发明所述的方法制备的冠突散囊菌固态发酵的银杏叶在制备生物发酵型饲料或饲料添加剂中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明银杏叶粉末加辅料作为固态发酵的初始培养基，以冠突散囊菌进行发酵。银杏叶经冠突散囊菌发酵后：
(1)各项品质成分如黄酮类化合物、聚异戊烯醇类化合物、孢子数、蛋白质有了显著提高，黄酮含量增加了8.12mg/g，聚异戊烯醇的含量增加了4.24mg/ml，孢子数在发酵后提高到了2.65×108cfu/g，蛋白质的含量增加到了1150.34mg/ml。
(2)发酵产物富含各种消化酶类，淀粉酶酶活最高达到4.6u/g，蛋白酶酶活最高达到407.52u/g，果胶酶活最高达到6436.39u/g，脂肪酶活最高达到86.67u/g，纤维素酶活最高达到2143.24u/g，半纤维素酶活最高达到6754.17u/g。
(3)发酵产物的抗氧化活性明显提高。
(4)香气成分组成发生了变化，具有明显的菌花香味，改善了银杏叶本身具有的苦涩味，增加银杏叶的香气，添加到饲料中提高饲料的适口性。
(5)有害成分银杏酚酸含量下降了52.4％，纤维素总量降解了20.1％，木质素降解了38.5％。
本发明在通过微生物冠突散囊菌发酵作用下，银杏叶中营养、功能成分均能得到提高，如蛋白质、黄酮类化合物、聚异戊烯醇类化合物增加；而有害成分银杏酚酸含量减少。同时各种酶的活性也显著提高将果胶、纤维素和木质素等降解，使得银杏叶的口感细腻，发酵银杏叶作为饲料或者添加到饲料中增加了饲料的适口性；有利于动物对饲料的吸收，提高饲喂效果。因此，冠突散囊菌固态发酵银杏叶有望成为新型生物发酵型饲料及饲料添加剂。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明。
主要试剂与药品：银杏叶为8～9月份新鲜采摘，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)购自青岛高科园海博生物技术有限公司，冠突散囊菌由南京林业大学苏二正课题组提供，其它试验试剂药品均为分析纯。
主要仪器设备：单人净化工作台，型号sw-cj-id，苏州净化设备有限公司；nikon显微镜，型号modeleslipsee200，尼康仪器(上海)有限公司；恒温恒湿箱，型号lhs-80hc-i，上海一恒科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，型号yxq-ls-75s11，上海博讯实业有限公司；台式高速离心机，型号tg16a-ws，上海卢湘仪仪器有限公司；紫外可见分光光度计，型号uv-1200，上海美谱达仪器有限公司。
冠突散囊菌的活化和孢子悬液的制备：
分离纯化：将在零下20℃保存的菌种取出，在无菌操作台上，用灭菌冷却后的接种环挑取边缘金黄色的菌落，用平板划线的方式接种到新鲜制取的pda培养基上。28℃，相对湿度85％，恒温恒湿培养。培养至平板上长有金黄色闭囊壳后(约72h)，用灭菌后的接种环挑取边缘金黄色的菌落，将菌种接种到新的pda上。重复上述操作2～3次。
孢子悬液的制备：在盛有无菌水的三角烧瓶中放入20～30颗玻璃珠，挑取pda平板培养到72h的冠突散囊菌移入无菌水中，摇床充分振荡，振荡条件是28℃，220rpm，45min。用血球计数板进行孢子计数，调节浓度。
实施例1
(1)将新鲜采摘的银杏叶去杂，洗净，电热鼓风干燥箱中于40℃干燥6h，用粉碎机粉碎过筛至40目大小，得到银杏叶粉末，取8.5g置于100ml的三角烧瓶中，厚度以盖满三角烧瓶的底部为佳；
(2)将银杏果在电热鼓风干燥箱中于60℃干燥5h，粉碎机粉碎过筛至40目大小，得银杏果全粉。将0.675g银杏果全粉加入到的100ml三角烧瓶中，再加入ph为4.5的磷酸盐缓冲溶液5g，将银杏叶粉末、银杏果全粉及缓冲液混匀，无菌封口膜封口，121℃高温高压灭菌20min，得银杏叶固态发酵培养基冷却后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得银杏叶固态发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，接种孢子数为7.14×106cfu，接种后于28℃，相对湿度85％发酵8天，得到冠突散囊菌发酵银杏叶。
实施例2
(1)将新鲜采摘的银杏叶去杂，洗净，电热鼓风干燥箱中于40℃干燥6h，用粉碎机粉碎过筛至40目大小，得到银杏叶粉末，取8.0g置于100ml的三角烧瓶中，厚度以盖满三角烧瓶的底部为佳；
(2)将豆饼在电热鼓风干燥箱中于60℃干燥5h，粉碎机粉碎过筛至40目大小，得豆饼粉。将0.735g豆饼粉加入到的100ml三角烧瓶中，再加入ph为4.0的磷酸盐缓冲溶液2.5g，将银杏叶粉末、豆饼粉及缓冲液混匀，无菌封口膜封口，121℃高温高压灭菌20min，得银杏叶固态发酵培养基冷却后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得银杏叶固态发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，接种孢子数4.5×106cfu。接种后于32℃，相对湿度90％发酵7天，得到冠突散囊菌发酵银杏叶。
实施例3
(1)将新鲜采摘的银杏叶去杂，洗净，电热鼓风干燥箱中于40℃干燥6h，用粉碎机粉碎过筛至40目大小，得到银杏叶粉末，取9.0g置于100ml的三角烧瓶中，厚度以盖满三角烧瓶的底部为佳；
(2)将银杏果去壳后所得的银杏果仁在电热鼓风干燥箱中于60℃干燥5h，粉碎机粉碎过筛至40目大小，得银杏果仁粉。将0.66g银杏果仁粉加入到的100ml三角烧瓶中，再加入ph为5.0的磷酸盐缓冲溶液7.5g，将银杏叶粉末、银杏果仁粉及缓冲液混匀，无菌封口膜封口，121℃高温高压灭菌20min，得银杏叶固态发酵培养基冷却后备用；
(3)在无菌条件下向步骤(2)制得银杏叶固态发酵培养基中接种冠突散囊菌孢子悬液，接种孢子数为12×106cfu。接种后于26℃，相对湿度75％发酵9天，得到冠突散囊菌发酵银杏叶。
实施例4
实施例4与实施例1原料和制备方法相同，不同之处在于将辅料银杏果全粉替换成大麦全粉和小麦全粉混合辅料，同时接种孢子数为9.56×106cfu。
试验例1
辅料添加对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1相同的方法和条件，分别考察玉米粉、米糠、豆饼、大麦全粉、小麦全粉、银杏果全粉、银杏果仁粉辅料添加对发酵银杏叶各指标的影响。每组做三个平行，分别检测发酵3天、5天和7天的数据，同时对比例1也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于不加入辅料，以同质量的银杏叶粉代替。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表1-3所示。
指标包括孢子数的变化、萜内酯含量的测定、原花青素含量的测定、黄酮含量的测定、酶类的测定、聚异戊烯醇的测定、酚酸类的测定、游离氨基酸的测定、可溶性糖的测定、蛋白含量的测定、抗氧化活性的测定、木质素和纤维素的测定、香气成分的测定。
具体方案如下：
(1)孢子数的变化
称取0.1g的发酵粉末于放有适量(本试验为10颗)玻璃珠的10ml试管中，加入10ml无菌水。恒温摇床振荡，28℃，220rpm，45min。用移液枪吸取5μl稀释的菌液于血球计数板，并滴加一滴棉兰染色剂，显微镜下进行孢子计数，记录数值。
(2)萜内酯含量的测定
建立标曲：配制1.42mg/ml银杏内酯a标准溶液10ml，用移液管分别吸取标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于6支20ml比色管中，每支比色管加70％(v/v)乙醇溶液至1.0ml，加入0.4ml预先配置好的碱性羟胺溶液(13.9％(w/w)盐酸羟胺水溶液+3.5mol/lnaoh溶液(1:2)混合，现用现配)，反应5min后加入0.4ml的3mol/lhci溶液和0.2ml的6％(w/w)fecl3溶液，混合均匀，再加入70％(v/v)乙醇溶液5ml，摇匀。在波长517mn处测定吸光值。
待测样品的制备：称取0.02g发酵的粉末于2ml离心管中，加入2ml70％(v/v)乙醇溶液，50℃、100w超声60min。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液进行测定。
样品测定：取1ml待测液于比色管中，每支比色管加70％(v/v)乙醇溶液至1.0ml，加入0.4ml预先配置好的碱性羟胺溶液(13.9％(w/w)盐酸羟胺水溶液+3.5mol/lnaoh溶液(1:2)混合，现用现配)，反应5min后加入0.4ml的3mol/lhci溶液和0.2ml的6％(w/w)fecl3溶液，混合均匀，再加入70％(v/v)乙醇溶液5ml，摇匀。在波长517mn处测定吸光值。
(3)原花青素含量的测定
建立标曲：用银杏叶原花青素标准品配成标准液并稀释至相应倍数，使得标准品浓度梯度分别为0.0129、0.0258、0.0387、0.0516、0.0645、0.0774、0.0903、0.1032、0.1161、0.1290mg/ml，1ml原花青素工作液加3ml显色剂，在室温下放置10min进行显色反应，反应后在644nm处检测波长，并绘制标准曲线。
待测样品的制备：称取0.02g发酵的粉末于2ml离心管中，加入2ml超纯水，50℃、100w超声60min。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液进行测定。
样品测定：原花青素含量测定选用4-二甲基肉桂醛(dmac)分光光度法，精确量取12.5ml浓盐酸、12.5ml水于100ml的容量瓶中，用无水乙醇定容至100ml制成酸性乙醇，酸性乙醇需现配现用。将50mg4-二甲基肉桂醛(dmac)用酸性乙醇定容至50ml配制成显色剂。1ml样品液加3ml显色剂，在室温下放置10min进行显色反应，反应后在644nm处检测波长。
(4)黄酮含量的测定
建立标曲：用芦丁标准品配成标准液并稀释至相应倍数，浓度梯度分别为0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048、0.056、0.064、0.072mg/ml，取0.5ml芦丁标准品工作液，加0.3ml5％(w/w)亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％(w/w)硝酸铝溶液0.3ml，放置6min，加入4％(w/w)氢氧化钠溶液4ml，70％(w/w)乙醇4.5ml，混合均匀后放置20min，在510nm下检测，并绘制标准曲线。
待测样品的制备：称取0.02g发酵的粉末于2ml离心管中，加入2ml的70％乙醇(v/v)，50℃、100w超声60min。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液进行测定。
样品测定：黄酮检测采用紫外分光光度计芦丁法。具体做法是：取0.5ml待测样品，加0.3ml5％(w/w)亚硝酸钠溶液，放置6min，加入10％(w/w)硝酸铝溶液0.3ml，放置6min，加入4％(w/w)氢氧化钠溶液4ml，70％(w/w)乙醇4.5ml，混合均匀后放置20min，在510nm下检测。
(5)酶类的测定
a、淀粉酶活力的测定：
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入ph为6.0的磷酸缓冲溶液10ml，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：加入20ml可溶性淀粉溶液(20g/l)于比色管中，加5ml缓冲溶液，60℃水浴预热5min。随后加入1ml样品溶液，60℃水浴反应5min，取1ml反应液于装有5ml稀碘液的试管中，混匀。660nm处测定吸光值，根据表格查得对应的酶活。
淀粉酶酶活定义：在60℃，ph6.0的条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需要的酶量为一个酶活力单位。
b、蛋白酶活力的测定：
标准曲线的建立：以l-酪氨酸(100μg/ml，0.1mol/l盐酸定容)为标准液，吸取0、1、2、3、4、5ml标准液，加蒸馏水到10ml，275nm直接测定吸光值。
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入ph为7.5的磷酸缓冲溶液，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：待测酶液2ml，预热2min，加入2ml酪素溶液(10g/l)，40℃水解10min，加入4ml三氯乙酸(0.4mol/l)终止液。离心，275nm测定上清液吸光值。
蛋白酶酶活定义：在40℃，ph7.5条件下，每分钟水解酪素释放出1μg酪氨酸所需要的酶量为一个酶活力单位。
c、果胶酶活力的测定：
标曲的建立：配制200、400、600、800、1000、1200μg/ml的半乳糖醛酸为标准液，吸取0.5ml标准液，加入1.5ml缓冲溶液和3mldns，100℃水浴7min，冷却后加10ml蒸馏水，550nm处比色。
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入ph为4.2的磷酸缓冲溶液10ml，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：反应加1.5ml的1％(w/w)果胶底物溶液，40℃预热10min，加入0.5ml待测酶液，40℃水解30min，加3mldns终止液，冷却后加10ml蒸馏水，550nm处比色。
果胶酶酶活的定义：在40℃，ph4.2的条件下，每分钟分解果胶产生1μg的半乳糖醛酸所需的酶量为一个酶活力单位。
d、脂肪酶活力的测定：
底物溶液的制备：4％(w/w)的聚乙烯醇：橄榄油＝3:1比例混合，高速匀浆处理6min。
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入ph为7.5的磷酸缓冲溶液10ml，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：取两个100ml三角瓶，分别作为空白a和样品b，分别加入底物溶液4ml和磷酸缓冲液(ph＝7.5)5ml，再于a中加入95％酒精15ml，于40℃±0.2℃水浴中预热5min,然后各加1ml待测酶液，立即混匀计时，准确反应15min之后，于b中立即补加15ml的95％的酒精终止反应，取出。于a、b瓶中各酚酞两滴，用0.01mol/l氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色，为滴定终点。记录消耗的氢氧化钠的体积。
计算公式：
x1——样品酶活(μ/g)
v1——消耗的氢氧化钠的体积
v2——滴定空白时消耗的氢氧化钠的体积
c——氢氧化钠标准溶液
n1——样品稀释倍数
e、纤维素酶活力的测定：
标准曲线的建立：配制浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg/ml的羧甲基纤维素钠2ml，加2ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液和5mldns，沸水浴5min，加水定容至25ml，540nm测定吸光值。
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液10ml，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：加入2ml待测酶液和2ml底物溶液混合，37℃水浴30min，反应完成后加5mldns终止液，加水定容至25ml，540nm测定吸光值。
纤维素酶酶活的定义：在37℃，ph5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
f、半纤维素酶活力的测定：
标准曲线的建立：吸取2、4、6、8、10ml浓度为2mg/ml的木聚糖溶液去离子水定容至10ml，再从各试管中吸取0.5ml木聚糖溶液，加入1mlph为4.8的柠檬酸缓冲溶液，3mldns终止液，沸水浴10min，加水16ml，550nm测定吸光值。
待测酶液的制取：称取0.1g发酵样品于10ml离心管中，加入ph为4.8的柠檬酸缓冲溶液10ml，超声45min，超声条件是100w，30℃。超声结束后10000rpm离心15min，取上清液为待测酶液。
测定方法：以1g/l的木糖溶液为底物，0.5ml木糖溶液加0.5ml待测液，50℃水浴30min，水浴完成后加3mldns终止液，沸水浴10min，加蒸馏水水16ml，550nm测定吸光值。
半纤维素酶酶活的定义：在50℃，ph4.8的条件下，每分钟从水解1g/l的木糖中释放1μg木聚糖所需要的酶量为一个酶活力单位。
(6)聚异戊烯醇的测定
称取发酵前后的银杏粉末0.1g的粉末于装有1ml石油醚的离心管中溶解，涡旋混匀。60℃超声提取2h，超声功率为80w。超声完成后10000rpm离心10min。取上清液hplp检测。
hplc测定条件是：色谱柱为依利特sinochromods-bp5μm(4.6nmx200mm)，配备佳杰c18保护柱，流动相为异丙醇：甲醇：正己烷：水＝45:22:25:3，柱温27℃，检测波长210nm，流速1ml/min，进样量10μl。
(7)酚酸类的测定
标曲的建立：准确称取银杏酚酸对照品0.1g于100ml容量瓶中，用无水甲醇溶解、定容，用45μmwhatman一次性针头过滤器过滤，得银杏酸标准溶液。准确吸取银杏酸标准溶液5ml置于25ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取适量该溶液于1cm石英比色皿中，以甲醇为参比，于310nm处测定吸光度；再分别准确吸取以上剩余溶液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00和2.50ml置于5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。测定310nm处的吸光度。以银杏酸浓度c为横坐标，吸光度a为纵坐标作图，线性回归得标准曲线方程。
样品的测定：准确称取发酵后的银杏叶粉末样品2g，加入正己烷300ml于85℃旋转蒸发干。用少量石油醚溶解加样于硅胶柱上(硅胶12g，硅胶柱为φ10mm×250mm的玻璃柱，湿法装柱)。先用石油醚50ml洗涤，再用石油醚：乙醚：甲酸(89:11:1)洗脱，收集银杏酸组分，浓缩至干。用无水甲醇溶解，置于25ml量瓶中定容，然后用0.45μmwhatman一次性针头过滤器过滤，310nm紫外分光光度测定。
(8)游离氨基酸含量的测定
标准曲线的制作：配制ph8.0磷酸盐缓冲液。以谷氨酸作为标准品，具体做法是：称取100mg谷氨酸溶于100ml水中，作为母液，准确吸取5ml母液，加水定容至50ml作为工作液。准确吸取母液1ml，注入25ml的容量瓶中，加0.5ml磷酸缓冲溶液和0.5ml茚三酮溶液在沸水浴中加热15min，待冷却后加水定容至25ml。放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，测定吸光度。以试剂空白溶液作参比分别吸取0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0ml氨基酸工作液与25ml容量瓶中，各加水4ml、磷酸缓冲液0.5ml和茚三酮溶液0.5％(w/v)沸水浴加热15min，冷却后加水定容25ml，测定吸光度，对应浓度绘制标准曲线。
测定样品时，准确吸取待测液1ml，注入25ml的容量瓶中，加0.5ml磷酸缓冲溶液和0.5ml茚三酮溶液在沸水浴中加热15min，待冷却后加水定容至25ml。放置10min后，用5mm比色杯，在570nm处，测定吸光度。
(9)游离氨基酸类别的测定
混合氨基酸标准储备液的配制：分别准确称取单个氨基酸标准品(l-天门冬氨酸33mg、l-苏氨酸30mg、l-丝氨酸26mg、l-谷氨酸37mg、l-脯氨酸29mg、甘氨酸19mg、l-丙氨酸22mg、l-缬氨酸29mg、l-蛋氨酸37mg、l-异亮氨酸33mg、l-亮氨酸33mg、l-酪氨酸45mg、l-苯丙氨酸41mg、l-组氨酸盐酸盐52mg、l-赖氨酸盐酸盐46mg、l-精氨酸盐酸盐53mg)(精确至0.001g)于同一50ml烧杯中，用83ml的6mol/l的盐酸溶液溶解，精确转移至250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释定容至刻度，混匀。
吸取适量发酵前后的茶汤试样中加入相同体积的盐酸混匀后，再用6mol/l的盐酸溶液补充至大约10ml。继续向水解管中加入3～4滴苯酚。将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，接到真空泵的抽气管上，抽真空，然后充入氮气。重复此操作3次后，再充氮气的状态下封口。将已封口的水解管放在110±1℃的水解炉内，水解22h后取出，冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤至50ml容量瓶内，用少量水多次冲洗水解管，水洗液移入同一容量瓶中，用水定容至刻度，振荡摇匀。准确吸取10ml滤液移入15ml试管内，用试管浓缩仪在40～50℃加热减压干燥，干燥后残留物用1～2ml水溶解，再减压干燥，最后蒸干。用10～20ml的ph2.2的柠檬酸钠缓冲溶液加入到干燥试管内溶解，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，待测。
氨基酸分析仪色谱条件是：磺酸型阳离子树脂，检测波长为570nm和440nm。测定方法是，等体积混合氨基酸标准工作液和样品测试液注入氨基酸分析仪，以外标法进行定性分析。
(10)蛋白质含量的测定
bradford贮存液：称取350mg考马斯亮g-250溶于100ml95％(v/v)乙醇，加入200ml85％(v/v)磷酸，置于4℃冰箱中保存。
bradford工作液：在425ml双蒸水中加入15ml95％(v/v)乙醇，30ml85％(v/v)磷酸和30mlbradford贮存液，混匀后置于4℃冰箱中保存。每次使用前，用滤纸过滤后使用。
标准曲线的制作：在若干离心管中分别加入500μg/ml的标准牛血清蛋白(bsa)标准溶液0μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl和70μl用超纯水补足到200μl；在各管中加入2mlbradford工作液，振荡混匀，室温放置5min，在595nm处测定吸光值，根据各组浓度下的吸光值与蛋白浓度的关系，绘制标准曲线。
样品的测定：吸取滤除菌丝后的发酵液1ml，放入10ml具塞刻度试管中，加入5ml考马斯亮蓝g-250蛋白试剂工作液，充分混合，室温下放置2min后用1cm比色杯在595nm下比色，记录光密度。通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量。
(11)抗氧化活性的测定
分别用超纯水，80％(v/v)甲醇、80％(v/v)乙醇、80％(v/v)丙酮提取银杏叶中的抗氧化活性成分。具体做法是称取0.02g发酵前后的粉末，分别加入2ml80％(v/v)甲醇、80％(v/v)乙醇、80％(v/v)丙酮，超声提取2h，超声条件是100w，60℃。超声完成后，10000rpm离心15min，取上清液作为样品待测液。
清除abts+自由基活性：
abts+(7mmol/l)与过硫酸钾按1:0.5混合，使得终物质的量浓度为2.45mmol/l，暗处反应12-16h产生abts+自由基，abts使用前，用甲醇稀释至734nm处吸光值为0.7±0.02。1ml样品液加4mlabts+自由基，在30℃反应6min后，在734nm处检测吸光值。
abts+自由基清除抑制率＝(a0-a1)/a0×100％
其中，a0为空白样的吸光值，a1为样品的吸光值。
清除dpph自由基活性：
将不同浓度的标准液0.1ml+3.9ml的25mg/l的dpph甲醇溶液(现配)，摇匀，暗处反应30min，515nm处检测。
dpph自由基清除抑制率＝(a0-a1)/a0×100％
其中，a0为空白样的吸光值，a1为样品的吸光值。
总还原力活性测定：
1ml样品加2.5ml磷酸盐缓冲液(200mmol/l，ph为6.6)，2.5ml1％(w/w)的k3[fe(cn)6]，在50℃反应20min后，加1ml10％(w/w)三氯乙酸，4000rpm离心10min，取2.5ml上清+2.5ml蒸馏水+0.5ml0.1％fecl3,室温静置10min后，在700nm测吸光值。
(12)木质素和纤维素的测定
中性洗涤剂：称取18.61g乙二胺四乙酸钠和6.81g四硼酸钠，放入1000ml的烧杯中，加少量水加热溶解后，加入30g十二烷基硫酸钠。另外称取4.65g无水硫酸二氢钠放入另一烧杯中，加少量水加热溶解后倒入第一个烧杯中，稀释到100ml。
酸性洗涤剂：称取30g十六烷三甲基溴化铵，溶于1000ml已标定过2.0mol/l的硫酸溶液中，搅动溶解，必要时过滤。
样品测定：首先使用中性洗涤剂处理样品(5g)，使其中大部分脂肪、糖、淀粉和蛋白质溶于洗涤剂中，称为中性洗涤溶解物(nds)。余下的不容物为中性洗涤纤维(ndf)。用酸性洗涤剂处理ndf，得到酸性洗涤溶解物(ads)和酸性洗涤纤维(adf)。用72％的硫酸消化adf，溶解其中的纤维素，消化后的质量差为纤维素的量。将余下的残渣灼烧，前后的质量差为木质素的量。
(13)香气成分的测定
称取发酵前后的银杏叶粉末10g，溶解于500ml煮沸的蒸馏水中。
精油提取和gc-ms测定方法：
采用减压蒸馏萃取法提取香精油，提取步骤如下：取500ml滤除菌丝的发酵液于梨形烧瓶中，水浴中旋转蒸发仪蒸干，收集冷凝液；取二氯甲烷加入到冷凝液中萃取，然后待分层后，将上层溶液再加二氯甲烷继续萃取，合并两次有机相，加入到盛有无水硫酸钠的具塞试管中低温过夜除去水分；第二天，用漏斗过滤除去硫酸钠后，加入内标癸酸乙酯2μl，然后水浴浓缩至1ml左右，低温保存至进样瓶中待用，gc-ms分析。
gc-ms分析采用内标法：以癸酸乙酯做内标。条件是：色谱柱db-5弹性石英毛细管柱。进样温度：250℃，不分流进样；载气：he，1ml/min；柱温程序：从40℃保持2min，以2℃/min升至110℃，再以3℃/min升至170℃，最后以4℃/min升至220℃；检测器温度：250℃，离子源温度230℃。
离子化方式：ei源；电子能量：70ev。扫描范围：50-650amu；试验中尽量将峰分开，保证峰形的对称，使用和谱库进行检索。
定性：采用谱库对质谱图进行检索结合保留指数进行定性分析。
表1辅料添加对发酵银杏叶各指标的影响
表2辅料添加对发酵银杏叶各指标的影响
表3辅料添加对发酵银杏叶各指标的影响
由表1-3可知，添加不同的辅料，对发酵银杏叶各指标的影响都不同。单纯从孢子数量来看，经过发酵后能使得孢子数增加。冠突散囊菌在发酵过程中并不会消耗萜内酯，因而萜内酯含量维持在稳定水平。原花青素极不稳定，自身极其容易被氧化，尤其是在高温高压灭菌这一步骤中，原花青素损失极多，发酵过程中有不同程度下降。黄酮含量变化明显，在整个过程中，黄酮的含量，呈现出先下降后上升的趋势。与对比例1相比，本发明的实施例明显提升了黄酮含量和孢子数。
加入辅料对酶的活性影响较为显著。加入辅料后，几种酶的活力与对比例1相比均明显提升，这是由于在原料中加入辅料时，冠突散囊菌的孢子能达到较高的水平，而由于这几种酶是散囊菌发酵过程中分泌的酶，因此酶的活力与冠突散囊菌孢子的数量呈正相关。
辅料的添加对果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶活力的影响较大，果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的存在有利于降解饲料中的粗纤维。果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的分泌主要集中在发酵前48h，48h时，两种酶活性达到最高，48h后两种酶酶活持续下降。加入辅料后纤维素酶和半纤维素酶活性在前3天明显高于对比例1，说明本发明实施例的酶作用效果更好。本发明的实施例对于对比例1果胶、纤维素和木质素等降解更多。
蛋白酶的活性受辅料种类的影响不大，蛋白酶的活性一直处于较高的水平，这有助于将饲料中的蛋白质在蛋白酶的作用下分解成小分子的多肽和氨基酸，促进动物对营养物质的消化吸收。
本发明如果单纯以孢子数作为指标来考察添加辅料的种类，则银杏果仁粉应当被选为最佳辅料。综合考虑对各种成分的含量的影响、酶的活力测定结果，以及对饲料成本的考虑，则选择银杏果全粉为最佳辅料。
试验例2
辅料添加量对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1的相同的方法和条件，考察调节辅料的浓度对发酵银杏叶各指标的的影响。每组做三个平行，分别检测发酵3天、5天和7天的数据，同时对比例也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于加入辅料的质量为银杏叶粉末和磷酸盐缓冲溶液总质量的1％、3％、9％；同时考察本发明中辅料的质量为7％的情况。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表4-6所示。
表4辅料浓度对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响
表5辅料浓度对几个酶活性的影响
表6辅料浓度对几个酶活性的影响
由表4-6可知，调节辅料的浓度，对淀粉酶活力的影响并不明显，这是由于在冠突散囊菌发酵的过程中，淀粉酶的分泌较为稳定，基本不受外界条件的干扰。其他酶的活性均受到辅料浓度的影响。当浓度从1％～5％(w/w)时，各类酶活性逐渐增加。当辅料浓度为5％(w/w)时，酶的活性达到最大值。此时，辅料浓度继续增加，酶的活性反而有所降低。本发明的实施例中的辅料浓度与对比例相比，黄酮含量和孢子数具有明显地提升，同时果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的分泌主要集中在发酵前48h，实施例里果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶活性在前3天明显高于对比例。本发明的实施例使用的辅料浓度对于对比例果胶、纤维素和木质素等降解更多，利于动物的吸收。
试验例3
发酵初始ph对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1的相同的方法和条件，考察发酵初始ph对发酵银杏叶各指标的影响。每组做三个平行，分别检测发酵3天、5天和7天的数据，同时对比例也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于加入磷酸盐缓冲液的初始ph为3.0和3.5；同时考察本发明中初始ph为4和5的情况。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表7-9所示。
表7发酵初始ph对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响
表8发酵初始ph对几个酶活性的影响
表9发酵初始ph对几个酶活性的影响
由表7可知，当ph为3～4.5时，孢子数随着ph值的增大而增大，当ph为4.5时最大。当ph继续增大时，孢子数有所减小。说明，冠突散囊菌适宜在酸性的条件下生长繁殖。且最适ph基本在4～5之间。萜内酯的含量虽基本维持在一个稳定的范围内，但随着ph的变化还是有所波动，这可能是因为萜内酯受到酸碱的影响后不稳定。原花青素的变化与孢子数的变化相一致。原花青素的含量极不稳定，高温、酸碱、甚至在常温环境下也极易氧化，因此在检测的过程中，原花青素的含量随着天数的增加而减少。稍有不同的是，黄酮的含量在ph为5的时候最高；黄酮含量不仅与原料本身、冠突散囊菌有关，还与酸碱度有关，在酸性较强的环境中，黄酮的含量会受到酸的影响而导致含量降低。所以，当ph为4.5时，发酵效果好。本发明的实施例中的发酵初始ph与对比例相比，黄酮含量和孢子数具有明显地提升。
由表8-9可知，当ph值变化时，对淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的活性的影响均较大。酶的活性随着ph的增加而增大，ph为4.5时，酶的活性最大。这是由于酶的活性本身就会受ph的影响。在发酵的过程中，冠突散囊菌分泌的胞外酶容易受到ph的影响，而胞内酶受到影响的原因是由于ph首先影响了冠突散囊菌的生长繁殖和代谢的方式，进而改变了胞内酶的分泌和活性，进而改变了酶的活性。而本试验的结果说明了不仅冠突散囊菌孢子数受到ph影响，其代谢方式和胞外胞内酶的分泌受到ph的影响更为明显。本试验将ph选择为4-5，而4.5选为最适酸碱度。果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的分泌主要集中在发酵前48h，本发明的实施例中的发酵初始ph与对比例相比，实施例里果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶活性在前3天明显高于对比例，说明本发明实施例的酶作用效果更好。本发明的实施例中的发酵初始ph对于对比例果胶、纤维素和木质素等降解更多，利于动物的吸收。
试验例4
接种量对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1的相同的方法和条件，考察接种量对发酵银杏叶各指标的影响。每组做三个平行，分别检测发酵3天、5天和7天的数据，同时对比例也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于加入冠突散囊菌孢子悬液接种量为2.38×106cfu、4.76×106cfu、11.90×106cfu；同时还考察本发明中9.52×106cfu的情况。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表10-12所示。
表10接种量对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响
表11接种量对几个酶活性的影响
表12接种量对几个酶活性的影响
接种量的多少直接影响着发酵培养基中孢子的数量和营养成分，但因为发酵添加的营养物质都十分有限，因此接种孢子的量也并非越多越好。由表10可知，在一定范围内，孢子数与接种量成正比，继续加大接种量，因为受到了空间和营养物质的制约，冠突散囊菌孢子数不再增加，甚至有所减少。萜内酯和原花青素的含量维持在比较稳定的状态。这基本可以说明冠突散囊菌的数量的多寡与萜内酯和原花青素的含量没有直接的关系，又或者说萜内酯和花青素不作为营养成分供给冠突散囊菌进行发酵。黄酮的含量呈现先升后降的趋势，是因为不仅在银杏叶中存在着黄酮，冠突散囊菌中也存在着一定量的黄酮，也就是说发酵物中总黄酮的含量由银杏叶被降解时所释放的量与真菌生长过程中自身所含有的黄酮的量共同决定。本发明的实施例中采用的接种量与对比例相比，黄酮含量和孢子数具有明显地提升。
由表11-12可知，接种量对酶的活性影响不亚于ph。当接种量为7.14×106cfu时，除半纤维素外的其他酶的活性相较于其他接种量均最高。而当接种量为9.52×106cfu时，半纤维素酶的活力最高。接种量对酶的影响是由于酶来源于菌种发酵时分泌的酶，所以菌种的数量直接影响的酶的活性。但由于空间和营养物质有限，接种量必须控制在一个合理的范围。果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的分泌主要集中在发酵前48h，本发明的实施例中的接种量与对比例相比，实施例里果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶活性在前3天明显高于对比例，说明本发明实施例的酶作用效果更好。本发明的实施例中的接种量对于对比例果胶、纤维素和木质素等降解更多，利于动物的吸收。
试验例5
缓冲液加入量对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1的相同的方法和条件，考察缓冲液加入量对发酵银杏叶各指标的影响。每组做三个平行，分别检测发酵3天、5天和7天的数据，同时对比例也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于缓冲液加入量，银杏叶粉末与磷酸盐缓冲溶液的质量比为8.5：10、8.5：12.5和8.5：15；同时还考察本发明中8.5：2.5,以及8.5：7.5的情况。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表13-15所示。表13缓冲液加入量对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响
表14缓冲液加入量对几个酶活性的影响
表15缓冲液加入量对几个酶活性的影响
在固体发酵培养基中，加入水的量(即缓冲液的量)对发酵培养的条件也十分重要，它的影响是多方面的，一是因为溶解到水中的营养物质的多寡决定着可被菌体利用的水溶性物质的多寡；二是因为菌体的生长需要一定潮湿度的环境，潮湿的程度，对菌体的生长影响也不同；三是因为加水的量的多寡会影响发酵菌体呼吸作用的方式，浸没在原料中的菌采用无氧呼吸分解代谢，而原料表面的菌则通过有氧呼吸进行物质交换。根据表13的结果，当加水量从2.5～7.5g时，孢子数和黄酮的含量都有所增加，其实本质的原因是由于加水量的增加，创造了菌体适宜的生长环境，由于孢子本身含有一定量的黄酮，因此黄酮的含量增加；另一方面此时酶活升高，降解了银杏叶中的粗纤维，使得黄酮的提取率增大，所以测得的黄酮含量升高。所以适宜的加水量有助于发酵的进行。本发明的实施例中采用的缓冲液的量与对比例相比，黄酮含量和孢子数具有明显地提升。
除了加水量对冠突散囊菌生长繁殖的数量有关以外，还与呼吸方式有关。根据表14-15的结果，加水量较多时，进行无氧呼吸的冠突散囊菌数量增多，酶的活性降低，合适的加水量，氧气充分，进行有氧呼吸的菌体越多，酶的活性就越高。因此，最佳加水量为5g。果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶的分泌主要集中在发酵前48h，本发明的实施例中的加水量与对比例相比，实施例里果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和脂肪酶活性在前3天明显高于对比例，说明本发明实施例的酶作用效果更好。本发明的实施例中的加水量对于对比例果胶、纤维素和木质素等降解更多，利于动物的吸收。
试验例6
发酵时间对发酵银杏叶各指标的影响。
采用实施例1的相同的方法和条件，考察发酵时间对发酵银杏叶各指标的影响。每组做三个平行，分别检测本发明中发酵7天、8天和9天的数据，同时对比例也采用实施例1的方法和条件，不同之处在于发酵1-6天。将平行组试验所得的数据整合，按照对应的方法计算其平均值及标准误差，进行数据的分析处理，绘制成图表，结果如表16-18所示。
表16发酵时间对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响
表17发酵时间对几个酶活性的影响
表18发酵时间对几个酶活性的影响
发酵时间在发酵中是不可或缺的重要因素之一，对发酵的影响也起着十分重要的作用。发酵时间对孢子数、萜内酯、原花青素、黄酮含量的影响见表16。在发酵进行的前192个小时内，孢子数随着发酵时间的延长不断增加，第216个小时开始下降，主要是因为此时冠突散囊菌的数量已达到极限，培养基中的碳氮源已消耗殆尽，孢子数量不再增加。萜内酯的含量保持稳定，说明萜内酯在常温下能够保持相对稳定。原花青素的含量随着发酵时间的延长不断降低，这是因为原花青素在常温下极易氧化分解。黄酮含量在前168小时内不断增加，说明随着菌丝的生长，黄酮的总量不断积累，192个小时黄酮开始下降，可能此时菌体的数量极大，而碳氮源几乎被消耗结束，黄酮等营养物质需要给菌体发酵提供能量。本发明的实施例中采用的发酵时间与对比例相比，黄酮含量和孢子数具有明显地提升。
发酵时间对几个酶活性的影响见表17-18。蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶在发酵前120个小时活性逐渐增加，尔后逐渐降低。说明在这些酶的分泌贯穿在冠突散囊菌生长过程中。而纤维素酶和半纤维素酶在发酵前48小时内不断增加，72小时逐渐降低，因为纤维素酶和半纤维素酶只在冠突散囊菌发酵的前期分泌，后期分泌明显减少。
这些酶的活力在优化后明显的提高，尤其是果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，它们能够有效的降解饲料中果胶、纤维素等，增加饲料的适口性。同时，蛋白酶和淀粉酶能够将饲料中原本的大分子营养物质酶解成小分子营养物质，促进动物消化吸收，提高饲料转化效率。故而本试验最适发酵时长为8天。
试验例7
发酵前后的银杏叶各指标成分测定：
采用本发明实施例1的方法，检测发酵前后银杏叶主要成分含量的变化及发酵前后银杏叶提取物抗氧化活性变化及发酵前后香气成分的变化，具体检测方法参见试验例1，结果如表19-20所示。
表19发酵前后银杏叶主要成分含量的变化
表20发酵前后银杏叶提取物抗氧化活性
由表19可知，发酵后蛋白质的含量显著增加，游离氨基酸的含量减少。二者的变化说明了在固态银杏叶发酵的过程中，氨基酸大部分会以结合态的形式储存于蛋白质中，其中包括植物组织蛋白和真菌蛋白。蛋白质对饲料的价值不仅表现在其含量的高低，还取决于蛋白质中不同氨基酸的构成比例，蛋白质中的必需氨基酸含量越高，蛋白质的营养价值就越高，当半必需氨基酸含量充足时，可以减少必需氨基酸的消耗，因此半必需氨基酸的营养价值也较高。还原糖的含量显著减少，是因为在发酵中并没有额外添加大量可供菌种发酵的大分子碳水化合物，因此后期碳源消耗结束后，菌种开始利用可溶性糖。聚异戊烯醇的含量在发酵后少量的增加，从发酵前的40.0849mg/g增加到了44.3393mg/g。聚异戊烯醇属于多烯醇类(或多萜醇类)，是一系列异戊烯基单元首尾相连构成的长链化合物，其分子中异戊烯基单元数为ll-20，有顺式和反式两种。酚酸类物质的含量在发酵后下降，这对于银杏叶发酵后作为饲料十分重要，因为银杏叶中含有的银杏酚酸具有致敏性、胚胎毒性及免疫毒性作用。木质素和纤维素的含量在发酵后均有不同程度的降低，这说明发酵过程中，冠突散囊菌降解了木质素和纤维素，提高了降解率，显著地提高银杏叶作为饲料饲喂效果。
由表20可知，在发酵后银杏叶提取物的抗氧化活性有不同程度的提高，不同溶剂的提取物的抗氧化活性不同。80％的丙酮提取效果显然比其他的提取剂提取效果好，对abts+自由基擦除效果最好，分别是发酵前3.94％、发酵后变为4.59％；测定dpph自由基清除力和总还原力时，80％的丙酮提取效果最好，dpph自由基清除力从发酵前的2.45％提高到了2.78％，总还原力从0.275提高到了0.373。发酵后银杏叶提取物的抗氧化活性提高，对提高银杏叶饲料的保健功能有着十分重要的意义。
发酵前，检测到的银杏叶粉末的香气成分有30种，多为醇类和少量的酯类。发酵后，香气成分也有30种，香气组分不同。在发酵后的银杏叶粉末的香气成分中，醇类物质减少，但醛类和酮类化合物增加。这些化学成分的增加与发酵过程中微生物的自动氧化作用有关。由此可见，经过微生物的发酵作用，香气组分发生了变化。香气成分变化的机理十分复杂，它们是在微生物胞外酶、热、氧气和水的共同作用下完成的。发酵后改善了银杏叶本身具有的苦涩味，增加银杏叶发酵饲料的香气，提高银杏叶饲料的适口性。