本发明属于作物种植技术领域，具体涉及一种缓解作物连作障碍的方法。
背景技术：
作物连作障碍（continuouscroppingobstacles或replantproblem、replantdisease）是指同一作物或近缘作物连作以后，即使在正常栽培管理的情况下，也会发生产量降低、品质变劣、生育状况变差的现象。可发生连作障碍的作物种类较多，如玉米、小麦、水稻、大豆、棉花、甘蔗、烟草、中草药、蔬菜、瓜果、花卉等均会发生连作病害。目前，作物连作障碍已成为农业可持续发展的重大问题，我国危害程度高的连作地块面积大于10%，其中规模化种植区发生面积一般超过20%。连作障碍导致作物损失巨大，占20%-80%，严重的几乎绝产，每年造成的经济损失可达数百亿元，同时还降低了农产品的安全性。
一般认为，作物连作障碍的发生基于以下三个方面的原因：①土壤养分不均衡和土壤理化性状劣变；②土壤病原菌累积和根际微生态功能失调；③次生代谢产物化感物质等引起的自毒作用。在这三个因素中，次生代谢产物引起的自毒作用可能是作物连作障碍发生的关键因素。
目前，普遍认为：植物根系分泌的酚酸类物质是造成连作障碍的化感自毒物质。酚酸类物质的种类主要有羟基肉桂酸、羟基苯甲酸和类黄酮类化合物。常见的羟基肉桂酸类化合物有阿魏酸、p-香豆酸、芥子酸、咖啡酸等；羟基苯甲酸类化合物主要有对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸和原儿茶酸等；类黄酮类化合物主要有花青素、黄酮及黄酮醇。此外，还包括双氢黄酮（醇）、异黄酮、黄烷醇等。
然而，一直以来对于酚酸类物质是造成连作障碍的化感自毒物质备受质疑。首先，相当部分酚酸类物质的化感活性的研究是在较高的酚酸浓度下进行的，而田间条件下土壤酚酸的浓度要显著低于实验室条件下抑制种子萌发和幼苗生长的浓度。如，在实验室条件下，抑制牵牛花幼苗生物量的20%，需要对香豆酸的浓度为0.13μmol/g土壤，但是目前已知在田间条件下对香豆酸的最大浓度＜0.03μmol/g土壤。土壤中酚酸的半衰期很短，加上土壤有较强的吸附作用等，会使得土壤中游离的酚酸浓度很低，致使酚酸的直接作用很弱。
为什么化感自毒物质对当茬植物没有或没有明显的影响，则被研究者所忽视，也即是忽视了在生物中普遍存在的对自产有毒次生代谢物的抗性机制。植物对自产有毒次生代谢物的抗性机制主要是：植物在合成毒性次生代谢物（成熟的终产物）之前，在次生代谢物合成途径的中间产物的诱导下，先合成出充分的高浓度的抗性赋予蛋白，然后才开始合成毒性次生代谢物，抗性赋予蛋白可将毒性次生代谢物转运（分泌）至根系外、或转运至细胞液泡中存储起来，从而使产毒植株获得对自产毒性次生代谢物的抗性。所以，植物产生的毒性次生代谢物对当茬植物没有或仅有很弱的自毒作用。而新生植株（种子萌发到幼苗）和生长迅速的植物组织中，以初生代谢为主，没有或合成很少抗性赋予蛋白，对上茬植物残留在土壤中的自毒次生代谢物十分敏感，发生自毒作用，即连作障碍。因此，应用抗性赋予蛋白活性抑制剂，抑制自毒物质的分泌，减少根系分泌物中自毒物质的含量，消除对下茬植物的危害，即可消除连作障碍。目前，亟待研究出可以缓解作物连作障碍的新方法。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种缓解作物连作障碍的方法，其选用抗性赋予蛋白活性抑制剂，抑制自毒物质的分泌，减少根系分泌物中自毒物质的含量，从而缓解自毒物质对下茬植物的抑制作用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种缓解作物连作障碍的方法，其在培养瓶中加入ms培养液，将培养好的幼苗移植至培养瓶中，于25－28℃、光照16h/黑暗8h，震荡培养5－10d；然后将幼苗用无菌水漂洗，移植于含抑制剂的ms培养液中培养2－5d即可；所述抑制剂的浓度为10－200μm。
具体的，所述抑制剂可以为格列本脲，硝苯地平或维拉帕米。抑制剂作用于幼苗根系，抑制根系抗性赋予蛋白的活性，从而抑制根系合成的自毒物质的分泌，减少根系分泌物中自毒物质的含量，缓解其对下茬植物的抑制作用。
进一步优选的，所述幼苗经下述步骤获得：用95%酒精浸泡种子，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗后，在预先放有无菌滤纸的培养皿中于25－28℃催芽24－48h，然后于25－28℃在ms培养基中，光照16h/黑暗8h，培养至两片真叶完全展开即得。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明方法用三种抗性赋予蛋白活性抑制剂格列本脲、硝苯地平和维拉帕米处理黄瓜苗，经试验验证，其可显著降低其根系分泌物对黄瓜种子萌发及之后幼苗下胚根伸长的抑制作用，具有明显的缓解黄瓜连作障碍的效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
以下以黄瓜为例，来详细说明本发明方法的效果。
实施例
一、材料。
1、黄瓜种子
市售黄瓜品种：豫艺寒育六号。
2、培养基（购于北京索莱宝科技有限公司）
ms培养液：配方为：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、cacl２·2h2o440mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2mno4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2-edta·2h2o37.3mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇（维生素b6）0.5mg/l、盐酸硫胺素（维生素b1）0.1mg/l、甘氨酸2mg/l；
ms培养基：在ms培养液配方基础上，添加琼脂7g/l。
3、抑制剂
格列本脲，硝苯地平，购自上海麦克林生化科技有限公司；
维拉帕米，购自北京博奥拓达科技有限公司。
二、方法。
1、种子表面消毒
用95v%酒精浸泡种子30s，0.1wt%升汞消毒5min，用无菌水漂洗3次。
2、抗性赋予蛋白活性抑制剂溶液配制
先用二甲基亚砜预溶，再加入无菌水配制成5mm的溶液。
3、抗性赋予蛋白活性抑制剂对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
在预先放有两层无菌滤纸的培养皿中，加入100μm的抗性赋予蛋白活性抑制剂溶液5ml，每皿播种黄瓜种子16粒，每个处理重复三次，随机排列于培养箱中培养，培养条件是25℃、光照16h/黑暗8h。每天补充适量的无菌水，以保持滤纸湿度。对照为无菌水处理。培养至种子发芽后，每24h统计1次发芽率，连续记录3d，计算发芽率，并调查发芽后3d的发芽势。6d后，测定幼苗的下胚轴长度。
4、抗性赋予蛋白活性抑制剂处理黄瓜苗后根系分泌物对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
（1）在预先放有两层无菌滤纸的培养皿中，加入5ml无菌水，每皿播种黄瓜种子16粒，于25℃、光照16h/黑暗8h的培养箱中培养。每天补充适量的无菌水，以保持滤纸湿度。培养至两片真叶完全展开。
（2）每个培养瓶中加入ms培养液50ml。将培养好的幼苗移植至培养瓶中，于25℃、光照16h/黑暗8h，40rpm震荡培养7d。然后进行抑制剂处理。
（3）将幼苗用无菌水漂洗后，移植于含50mlms培养液的新培养瓶中，每瓶加入适量的抑制剂溶液，抑制剂的使用浓度均为100μm。培养3d。取出幼苗，收集培养液即为根系分泌物溶液。
4、根系分泌物对种子萌发的影响
在铺有两层滤纸的直径为10cm培养皿（预先灭菌）中，加入5ml根系分泌物溶液（预先过滤除菌），每皿均匀分布16粒黄瓜种子（种子预先表面消毒），每处理重复3次，随机排列于25℃培养箱中，光照16h/黑暗8h培养。每天补充适量的无菌水，以保持滤纸湿度。对照为无菌水处理。培养至种子发芽后，每24h统计1次发芽率，连续记录3d，计算发芽率，并调查发芽后3d的发芽势。6d后，测定幼苗的下胚轴长度。
三、结果。
1、抗性赋予蛋白活性抑制剂对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
在培养皿两层滤纸中，加入100μm的抗性赋予蛋白活性抑制剂溶液，播种黄瓜种子，检测抗性赋予蛋白活性抑制剂对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响。三种抗性赋予蛋白活性抑制剂中，格列本脲和硝苯地平对黄瓜种子发芽没有影响，而维拉帕米有轻微影响。格列本脲和硝苯地平对下胚轴伸长有一定的抑制作用，下胚轴长度比无菌水对照短17.9%和25.7%，维拉帕米对下胚轴伸长有较强抑制作用，下胚轴长度比水对照短72.0%（详见表1）。
表1抗性赋予蛋白活性抑制剂对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
2、抗性赋予蛋白活性抑制剂处理黄瓜苗后根系分泌物对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
在ms培养液中添加抗性赋予蛋白活性抑制剂培养黄瓜苗，收集根系分泌物溶液，加入到培养皿两层滤纸中，播种黄瓜种子，检测抗性赋予蛋白活性抑制剂处理黄瓜幼苗后，根系分泌物对黄瓜种子发芽和下胚轴长度的影响，结果见表2。
与无菌水对照相比，格列本脲处理的黄瓜根系分泌物对黄瓜种子发芽没有影响，而硝苯地平和维拉帕米处理的黄瓜根系分泌物有一定的影响。未加抑制剂处理的黄瓜根系分泌物对种子发芽也有一定的影响。用格列本脲处理的黄瓜根系分泌物解除了根系分泌物对种子发芽的抑制作用，而用硝苯地平和维拉帕米处理的黄瓜根系分泌物对种子发芽的抑制作用没有相应地解除。没用抗性赋予蛋白活性抑制剂处理的黄瓜根系分泌物对幼苗下胚轴伸长有强的抑制作用，下胚轴长度比无菌水对照短78.9%，三种抗性赋予蛋白活性抑制剂格列本脲、硝苯地平、维拉帕米均可显著降低黄瓜根系分泌物对黄瓜幼苗下胚轴伸长的抑制作用，下胚轴长度比无菌水对照分别短49.9%、62.9%和58.3%。与没用抗性赋予蛋白活性抑制剂处理相比，三种抗性赋予蛋白活性抑制剂处理后，黄瓜幼苗下胚轴长度分别提高138%、76%和98%（见表2）。
表2黄瓜根系分泌物对黄瓜种子发芽和下胚轴伸长的影响
四、结论
用三种抗性赋予蛋白活性抑制剂格列本脲、硝苯地平和维拉帕米处理黄瓜苗，尤其是格列本脲，可显著降低其根系分泌物对黄瓜种子萌发及之后幼苗下胚根伸长的抑制作用，具有明显的缓解黄瓜连作障碍的效果。